CRISPR‑Cas9特异性敲除猪SLA‑3基因的方法及用于特异性靶向SLA‑3基因的sgRNA与流程

文档序号:11141470阅读:来源:国知局

技术特征:

1.在CRISPR-Cas9特异性敲除猪SLA-3基因中用于特异性靶向SLA-3基因的sgRNA,其特征在于:

(1)所述sgRNA在SLA-3基因上的靶序列符合5’-N(20)NGG-3’的序列排列规则,其中N(20)表示20个连续的碱基,其中每个N表示A或T或C或G,符合规则的靶序列可以位于正义链或反义链;

(2)所述sgRNA在SLA-3基因上的靶序列位于SLA-3基因的N端的5个外显子编码区,或序列的主要部分位于SLA-3基因的N端的5个外显子,其余部分跨越与相邻内含子的交界,位于相邻内含子;

(3)所述sgRNA在SLA-3基因上的靶序列是唯一的。

2. 根据权利要求1所述的用于特异性靶向SLA-3基因的sgRNA,其特征在于,所述靶序列为序列表中SEQ ID NO:1~115中任一条序列所示的序列。

3. 根据权利要求1所述的用于特异性靶向SLA-3基因的sgRNA,其特征在于,所述靶序列为序列表中SEQ ID NO:4、5或12所示的序列。

4. CRISPR-Cas9特异性敲除猪SLA-3基因的方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:

(1)在权利要求1-3任一项所述的sgRNA的靶序列的5’-端加上用于形成粘性末端的序列,合成得到正向寡核苷酸序列;在权利要求1-3任一项所述的sgRNA的靶序列对应的互补序列的两端加上合适的用于形成粘性末端的序列,合成得到反向寡核苷酸序列;将合成的所述正向寡核苷酸序列与反向寡核苷酸序列退火、复性,形成具有粘性末端的双链寡聚核苷酸;

(2)将所述双链寡聚核苷酸连入线性化的携带Cas9基因的表达载体,得到携带含相应靶序列的sgRNA寡聚核苷酸和Cas9基因的表达载体,转化感受态细菌,筛选鉴定出正确的阳性克隆,并对所述阳性克隆摇菌、提取质粒;

(3)用所述携带有sgRNA寡聚核苷酸和Cas9基因的表达载体、包装质粒和包装细胞系包装出同时携带靶向SLA-3基因的sgRNA和Cas9的假型慢病毒;

(4)使用所述假型慢病毒感染目的细胞,并进一步培养;然后收集被感染的目的细胞,以其基因组DNA为模板扩增包含所述靶序列的基因片段,经过变性、复性及酶切,确定SLA-3基因的敲除情况。

5. 根据权利要求4所述的CRISPR-Cas9特异性敲除猪SLA-3基因的方法,其特征在于,所述表达载体为序列表中SEQ ID NO:116所示序列的载体。

6.根据权利要求4或5所述的CRISPR-Cas9特异性敲除猪SLA-3基因的方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:

(1)在权利要求1-3任一项所述的sgRNA的靶序列的5’-端加上CACCG序列,合成得到正向寡核苷酸序列;在权利要求1-3任一项所述的sgRNA的靶序列对应的互补序列的5’-端加上AAAC序列、3’-端加上C,合成得到反向寡核苷酸序列;将合成的所述正向寡核苷酸序列与反向寡核苷酸序列退火、复性,形成具有粘性末端的双链寡聚核苷酸;

(2)将所述双链寡聚核苷酸连入如序列表中SEQ ID NO:116所示序列的表达载体lentiCRISPR v2经BsmB I限制性内切酶酶切得到的线性化载体,得到携带sgRNA寡聚核苷酸的重组表达载体lentiCRISPR v2- SLA-3,转化感受态细菌,筛选鉴定出正确的阳性克隆,并对所述阳性克隆摇菌、提取质粒;

(3)用所述表达载体lentiCRISPR v2- SLA-3、包装质粒和包装细胞系包装出同时携带靶向SLA-3基因的sgRNA和Cas9的假型慢病毒;

(4)使用所述假型慢病毒感染目的细胞,并进一步培养;然后收集被感染的目的细胞,以其基因组DNA为模板扩增包含所述靶序列的基因片段,经过变性、复性及酶切,确定SLA-3基因的敲除情况。

7.根据权利要求6所述的CRISPR-Cas9特异性敲除猪SLA-3基因的方法,其特征在于,所述包装质粒为质粒pLP1、质粒pLP2和质粒pLP/VSVG;所述包装细胞系为HEK293T细胞。

8.根据权利要求6所述的CRISPR-Cas9特异性敲除猪SLA-3基因的方法,其特征在于,所述目的细胞为猪PIEC细胞;

所述以其基因组DNA为模板扩增包含所述靶序列的基因片段,经过变性、复性及酶切,确定SLA-3基因的敲除情况,具体为:

(a)以感染病毒的目的细胞的基因组DNA为模板,用SLA-3基因的上下游引物扩增包含所述sgRNA的靶序列的SLA-3基因片段,同时用相同引物扩增未感染病毒的野生型细胞的基因组DNA;

(b)纯化上述扩增到的SLA-3基因片段,然后将来自感染病毒的目的细胞的SLA-3基因片段与来自野生型细胞的SLA-3基因片段等量混合、加热变性、复性,形成杂交DNA分子;

(c)用Cruiser酶切割复性后的杂交DNA分子;

(d)电泳检测酶切产物,检测靶序列介导的SLA-3基因敲除效果。

9. 在CRISPR-Cas9特异性敲除猪SLA-3基因的方法中用到的重组表达载体lentiCRISPR v2- SLA-3,其特征在于,所述重组表达载体的骨架载体的序列如序列表中SEQ ID NO:116所示;所携带的靶序列如权利要求1-3任一项所述的sgRNA的靶序列,优选序列表中SEQ ID NO:4、5或12所示的靶序列。

10. 如权利要求1-3任一项所述的sgRNA或权利要求9所述的重组表达载体lentiCRISPR v2- SLA-3在CRISPR-Cas9特异性敲除猪SLA-3基因的方法中的用途。

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