本发明涉及干细胞培养领域，特别涉及一种干细胞培养体系及其培养方法。
背景技术：
干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞。根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。干细胞是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。
公开号为CN103305466A的中国专利《一种保持高细胞活率的神经干细胞培养方法》公开了一种保持高细胞活率的神经干细胞培养方法,在无血清的DMEM/F12培养基中，对神经干细胞交替进行悬浮与贴壁培养。
但是这种保持高细胞活率的神经干细胞培养方法存在以下缺点:在培养基内交替进行悬浮与贴壁培养,神经干细胞所处的环境与体内自然生长的状态想去甚远,导致在体外培养的神经干细胞在培养室逐渐丧失了原有的性状,在形态、结构和功能方面都于其在体内自然生长的状态想去甚远。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种干细胞培养体系及其培养方法，具有模拟体内微环境的效果。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种干细胞培养体系，由下到上依次包括饲养层细胞、设置于所述饲养层细胞上方的一层用于分离饲养层细胞和干细胞的细胞筛网、三维培养基，所述三维培养基包括由Matrigel制作而成的三维支架和完全培养基，所述完全培养基包括DMEM培养基、FCS、β-疏基乙醇、LIF、谷氨酰胺和胰岛素。
干细胞是一类具有高度自我复制能力和多向分化潜能的原值未特化细胞的统称，被广泛应用于生命科学、医学等领域的科研。在体外二维培养时，贴壁生长，与体内环境相差较大，容易造成细胞凋亡和畸变。现有多种商业化的干细胞，本发明采用商购的干细胞，不涉及任何伦理道德。Matrigel是从富含胞外基质担保的EHS小鼠肿瘤中分离出来的重组基质成分，Matrigel的主要成分是层黏连蛋白，一种可溶性的大分子蛋白质，层黏连蛋白上存在供干细胞表面黏附分子的结合位点，供干细胞结合和粘附，进而形成供细胞附着和生长的类似脚手架的多孔结构，使干细胞能依附于三维支架进行三维生长和迁移。通过在培养体系中模拟体内的三维环境，在干细胞增殖培养时，降低凋亡率，使干细胞呈现高核质比，增强干细胞的分化能力和驱化因子的表达。
Matrigel除了层黏蛋白外，还包括多种细胞外基质、蛋白酶和生长因子成分，通过这些物质的协同作用参与干细胞的生长、分化、迁移和组织形成，并能诱导干细胞表达必要的蛋白质以附着于三维支架上，从而促进细胞与三维支架之间、细胞与细胞之间更好的连接，因此，Matrigel相比于其他三维支架更能发挥生物学调节功能，能更好地模拟干细胞在体内所处的微环境。
干细胞在用于科研时，需经过增殖扩大后再进行分化培养。在增值扩大培养过程中，培养体系需要满足两个基本条件，一是促进细胞的分裂增殖，二是抑制细胞的分化。在干细胞培养过程中，DMEM培养基是一种含有各种氨基酸和葡萄糖的培养基，用于供给干细胞培养过程中所需的各种营养成分。在完全培养基中加入β-疏基乙醇，β-疏基乙醇具有促进干细胞增殖分裂的作用。谷氨酰胺是细胞合成蛋白质和核酸所必需的物质，在干细胞增殖培养时对谷氨酰胺的要求较高，缺乏时容易造成干细胞的凋亡。干细胞增殖时是进行连续分裂进行增殖，增殖时需要合成蛋白质和核酸，而DMEM培养基是不含有核苷酸，而核苷酸又是细胞合成核酸的原料，因此加入核苷酸保证干细胞分裂时有充足的原料。在干细胞增殖时胰岛素样生长因子具有显著的促进作用，但是在实际过程中存在提取十分困难，胰岛素与胰岛素样生长因子不仅结构类似，功能上也一致，通过用胰岛素代替胰岛素样生长因子，来实现对干细胞增殖的促进作用。通过加入DMEM培养基、核苷酸、谷氨酰胺等为干细胞增殖提供足够的原料，用β-疏基乙醇和胰岛素协同作用促进干细胞的增殖，使干细胞数量在培养时能快速扩大。
LIF的英文全称为Leukemia Inhibitory Factor,中文译为白血病抑制因子,其为一种具有多种功能的细胞因子,但其最重要的应用是维持胚胎干细胞等的未分化状态。在培养体系的下方设置一层饲养层细胞，饲养层细胞是一些特定的细胞如颗粒细胞、成纤维细胞、输卵管上皮细胞等已在体外培养的细胞，在经有丝分裂阻断处理后得到的细胞单层，饲养层细胞大部分可用小鼠胚胎成纤维细胞。一般对饲养层细胞的要求为不分裂不增殖而保持代谢活性，分泌干细胞在体外存活增殖所述必须的生长因子，是干细胞培养，特别是胚胎干细胞培养中用到的生长增殖促进剂和分化抑制剂。通过LIF和饲养层细胞的联合作用，共同抑制干细胞在培养过程中不会被分化。
在干细胞和饲养层细胞共同培养时，干细胞沿三维支架迁移和延伸时会接触或进入饲养层细胞中，虽然两种细胞之间的结合力较弱，但在后续的增殖及分化试验中分离时却十分困难，耗时耗力。通过在饲养层细胞上方设置一层细胞筛网，既能使饲养层细胞分泌的生长因子透过细胞筛网之间的孔径渗透到培养基内，又能防止干细胞与饲养层细胞接触，实现饲养层细胞和干细胞的隔离培养，不仅方便分离，而且也能避免饲养层细胞混入干细胞内后形成安全隐患，提高生物安全性。
通过用DMEM培养基、谷氨酰胺、核苷酸、组成的完全培养基，为干细胞培养时提供充足的原料，Matrigel中层黏连蛋白形成模拟体内的三维环境的支架，Matrigel中的种细胞外基质、蛋白酶和生长因子成分和饲养层细胞分泌的生长因子组成模拟体内细胞外基质的生物成分，通过三维支架和生物成分模拟出干细胞在体内所处的细胞外基质，使干细胞培养时在体外环境与其在体内相似，从而避免环境因素而导致细胞畸变甚至歪曲科研实验结果。饲养层细胞和β-疏基乙醇、胰岛素共同作用促进干细胞的增殖，饲养层细胞又和LIF协同作用，抑制干细胞在增殖时发生分化。
本发明的进一步设置为：所述完全培养基以DMEM培养基为基础，包括15％的所述FCS，所述β-疏基乙醇浓度为0.1mmol/ml，所述LIF浓度为1.5×103U/ml，所述谷氨酰胺浓度为200ug/ml，所述胰岛素浓度为10-50ng/ml。
通过采用上述技术方案，LIF浓度为1.5×103U/ml,避免使LIF保持有效的生物活性，胰岛素浓度为10-50ng/ml,浓度不会过早而造成毒性较高而影响，β-疏基乙醇浓度为0.1mmol/ml，使β-疏基乙醇浓度具有促进干细胞增殖的活性。
本发明的进一步设置为：所述完全培养基还包括0.1ug/ml的胎球蛋白。
通过采用上述技术方案，胎球蛋白是一种发现胎牛血清的蛋白质，两条肽链自同一前体切割产生并以一对二硫键相连，现有技术中公开了多种从胎牛血清中分离出胎球蛋白的方法。胎球蛋白在加入干细胞培养体系后，能提高干细胞的活性，对干细胞的增殖具有促进作用。
本发明的进一步设置为：所述完全培养基还包括0.4uM的爱帕琳肽。
通过采用上述技术方案，爱帕琳肽是一种由人类染色体上的APLIN基因产生的多肽，可以采用商购或合成的爱帕琳肽，通过加入到培养体系后，能提高干细胞的增殖活性，促进干细胞在三维支架上的增殖和迁移。
本发明的进一步设置为：所述完全培养基还包括0.5uM的Blebbistatin。
通过采用上述技术方案，Blebbistatin是一种选择性的肌球蛋白ATP酶抑制剂，对干细胞在增值过程中的分化具有抑制作用，通过与饲养层细胞、β-疏基乙醇等联合作用，共同抑制干细胞在增值时的分化和畸形。
本发明的进一步设置为：所述完全培养基还包括浓度为100ng/ml硫酸乙酰肝素2。
通过采用上述技术方案，硫酸乙酰肝素2是一种碳水化合物，它是细胞表面某些蛋白质的包被物，对干细胞特别是胚胎干细胞的正常增殖和潜能非常重要，缺少硫酸乙酰肝素2时，促进干细胞更新的三种主要细胞外因子Wnt、FGF、BMP无法正确向细胞内传递信号，导致干细胞生长缓慢，并且会自动分化成其他细胞。虽然Matrigel内含有硫酸乙酰肝素2，但是为保证干细胞的正常增殖和更新，向完全培养基内加入硫酸乙酰肝素2，保证硫酸乙酰肝素2有充足的含量。
本发明的进一步设置为：所述完全培养基还包括10ug/ml的维生素E。
通过采用上述技术方案，通过在完全培养基内加入维生素E，为干细胞提供维生素，同时维生素E具有抗氧化的作用。
本发明的进一步设置为：所述DMEM培养基为高糖型。
通过采用上述技术方案，相比于低糖浓度的DMEM培养基，高浓度的糖会提高干细胞的增殖速度，在增殖培养中缩短培养周期和时间。
本发明的进一步设置为：所述细胞筛网孔径为1um-100um。
通过采用上述技术方案，细胞筛网根据培养干细胞大小的不同，选择合适孔径的筛网对干细胞进行隔离培养。
本发明的另一个目的在于提供一种用上述干细胞培养体系培养干细胞的培养方法。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种用如权利要求1所述的细胞培养体系培养干细胞的方法，a)在培养容器内制备一层饲养层细胞；b)将一层细胞筛网固定于培养容器内且位于饲养层细胞上方；c)制备干细胞悬液，与Matrigel等比例混合后，加入到培养容器内,静置；d)向培养容器内加入完全培养基，每天更换一次完全培养基。
通过采用上述技术方案，饲养细胞位于培养容器底部，通过细胞筛网与干细胞进行隔离培养，将干细胞制作悬液后，与Matrigel等比例混合后形成三维培养体系，最后向培养容器内加入完全培养基，液态的完全培养基浸入到三维支架内部，为附着于三维支架上的干细胞提供养分。
综上所述，本发明具有以下有益效果：采用Matrigel和饲养细胞分泌的生长因子共同模拟出干细胞在体内所处的细胞外基质，使细胞在体外生活环境和其在体内相似，保证细胞的增殖和正常形态，同时通过饲养层细胞和β-疏基乙醇、胰岛素共同作用促进干细胞的增殖，饲养层细胞又和LIF协同作用，抑制干细胞在增殖时发生分化，使干细胞在保持增殖活性的同时不会发生分化，其次，在饲养层细胞上方设置一层细胞筛网，将干细胞和饲养层细胞进行隔离培养，便于后续的细胞分离，达到了模拟体内细胞质基质、干细胞活性高、生物安全性高、分离方便的效果。
具体实施方式
具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
实施例1：一种干细胞培养体系的培养方法，包括a),在培养容器内制备一层饲养层细胞，商购MEF细胞，配置MEF生长培养基，用高糖培养基和10％FCS配制；准备一只15ml离心管，加5ml预热MEF生长培养基，取一只液氮冻存的MEF细胞，37摄氏度水浴中轻轻振荡，细胞融化后转移到离心管中；离心后收集细胞，悬于10mlMEF生长培养基，接种150mm组织培养皿，加MEF生长培养基至25ml，37摄氏度孵育至细胞长满。细胞长满后加入丝裂霉素C，吸掉培养基，加入新配制的含10ug/ml的丝裂霉素C的MEF生长培养基。37摄氏度孵育2.5小时，其中丝裂霉素C母液，2ml丝裂霉素C溶于5ml无菌PBS。母液用铝箔包裹，使用时用MEF生长培养基稀释至终浓度10ug/ml。孵育的同时准备明胶处理的滋养细胞培养皿；去掉培养基，10mlPBS冲洗三次，完全去除丝裂霉素C，加入10ml胰酶溶液，37摄氏度孵育5分钟。加入3mlMEF生长培养基，吹吸分散细胞，转移至15ml离心管。离心收集细胞，悬于10mlMEF生长培养基，计数细胞。丝裂霉素处理的MEF细胞以合适密度接种明胶包被的培养容器内。
b)将一层细胞筛网固定于培养容器内，且位于饲养层细胞的上方。细胞筛网的孔径间隙为1um。
c)选用商购的小鼠胚胎干细胞作为试验的干细胞，制备干细胞悬液，将干细胞离心后收集细胞沉淀，加入5ml预热至37摄氏度的完全培养基制备细胞悬液，选取5ml干细胞悬液与5mlMatrigel混合均匀后加入到培养容器内，静置5分钟。完全培养基成分按以下表1中的比例进行配置。
d)向培养容器内加入10ml完全培养基，每天更换一次完全培养基。换液时吸取10ml完全培养基后，加入10ml完全培养基。
细胞凋亡率检测：从培养容器内取悬浮培养的细胞0.3ml，放在流式细胞仪测定试管中，用液氮冻结，室温下溶解，然后加入3mmol/L的PI30ul,5分钟后，用流式细胞仪检测，并将检测结果在表1中列出。各实施例与对比例之间采用t检验，以α＝0.05为检验水准，采用SPSS17.0数据分析系统，计量资料用均数(x±s)表示。
核质比检测：核质比高是干细胞的重要形态特征之一，用来鉴定干细胞是否分化。从培养容器内取悬浮液5ml,吹打成单细胞悬液，离心后弃上清，37摄氏度孵育5分钟，加固定液，固定液由甲醇：冰醋酸＝3:1混匀，制作成涂片，用HE染色后，用Image Pro plus 5软件进行分析，得出核质比，并将检测加过在表1中列出。其中实施例与对比例采用t检验，以α＝0.05为检验水准，采用SPSS17.0数据分析系统，计量资料用均数(x±s)表示，P＜0.05为显著性差异，P＜0.01为极显著性差异。
实施例2：一种干细胞培养体系的培养方法，与实施例1的不同之处在于，完全培养基成分按照以下表1的成分配置，并进行细胞凋亡率和核质比检测后将结果在表1中列出。
实施例3：一种干细胞培养体系的培养方法，与实施例1的不同之处在于，完全培养基成分按照以下表1的成分配置，并进行细胞凋亡率和核质比检测后将结果在表1中列出。
实施例4：一种干细胞培养体系的培养方法，与实施例1的不同之处在于，完全培养基成分按照以下表1的成分配置，并进行细胞凋亡率和核质比检测后将结果在表1中列出。
实施例5：一种干细胞培养体系的培养方法，与实施例1的不同之处在于，完全培养基成分按照以下表1的成分配置，并进行细胞凋亡率和核质比检测后将结果在表1中列出。
实施例6：一种干细胞培养体系的培养方法，与实施例1的不同之处在于，完全培养基成分按照以下表1的成分配置，并进行细胞凋亡率和核质比检测后将结果在表1中列出。
对比例1：一种干细胞培养体系的培养方法，与实施例1的不同之处在于，完全培养基成分按照以下表1的成分配置，采用现有二维技术进行培养，不加入Matrigel，并进行细胞凋亡率和核质比检测后将结果在表1中列出。
对比例2：一种干细胞培养体系的培养方法，与实施例1的不同之处在于，完全培养基成分按照以下表1的成分配置，并进行细胞凋亡率和核质比检测后将结果在表1中列出。
对比例3：一种干细胞培养体系的培养方法，与实施例1的不同之处在于，完全培养基成分按照以下表1的成分配置，制备饲养层细胞，并进行细胞凋亡率和核质比检测后将结果在表1中列出。
对比例4：一种干细胞培养体系的培养方法，与实施例1的不同之处在于，完全培养基成分按照以下表1的成分配置，并进行细胞凋亡率和核质比检测后将结果在表1中列出。
对比例5：一种干细胞培养体系的培养方法，与实施例1的不同之处在于，完全培养基成分按照以下表1的成分配置，并进行细胞凋亡率和核质比检测后将结果在表1中列出。
表1