本发明涉及一种蛋白酶抑制剂的制备方法。
背景技术：
丙型肝炎病毒(HCV) 感染是在相当数量的感染个体中引起慢性肝脏疾病例如肝硬化和肝细胞癌的主要健康问题。当前HCV 感染的治疗包括单独使用或与核苷类似物利巴韦林组合使用重组干扰素-α 的免疫治疗。几种病毒编码的酶是治疗干预的公认靶标，包括金属蛋白酶(NS2-3)、解旋酶(NS3，全长)、NS3 蛋白酶辅助因子(NS4A)、膜蛋白质(NS4B)和RNA- 依赖性RNA 聚合酶(NS5B)。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种蛋白酶抑制剂的制备方法，该方法获得的蛋白酶抑制剂可用于抑制HCV( 丙型肝炎病毒)NS3蛋白酶、预防或治疗一种或多种HCV 感染的症状。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是设计1、一种蛋白酶抑制剂的制备方法，包括以下步骤：
1）将3- 羟基喹啉-4- 甲酸的THF溶液用NBS处理，并在室温搅拌2.5小时；该反应混合物然后用EtOAc萃取，用水随后用Na2S2O3水溶液洗涤；将合并的有机层用Na 2SO4干燥和浓缩，得到中间体产物；
2）在0℃向步骤1的粗产物在MeOH中的溶液中，加入甲苯和(三甲基甲硅烷基) 重氮甲烷并搅拌；将反应混合物升温至室温并搅拌30分钟；粗LC-MS显示出起始材料全部消耗；将AcOH加入到反应混合物中，直到鼓泡停止；蒸发有机物，将粗残留物溶于甲苯并蒸发，得到为棕色固体的粗产物，使用(0-5)％ EtOAc-己烷作为流动相将其通过硅胶柱色谱法进行纯化，得到纯的中间体产物；
3）向步骤2的产物在DMF中溶液中，加入Cu-I，接着加入MFSDA；然后在微波高吸光度下将反应混合物中在100℃加热30分钟；将反应用EtOAc稀释，用盐水和水洗涤；将有机物用Na2SO4干燥，浓缩并用40％己烷/EtOAc 进行纯化，得到中间体产物；
4）将步骤3的产物、三丁基(1-乙氧基乙烯基)锡和Pd(PPh3)4于二噁烷中的混合物在回流下加热过夜；将反应混合物冷却至室温，加入10ml 1N HCl，并在室温搅拌90 分钟；反应混合物然后用水稀释，用DCM 萃取3次；将合并的有机层用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤，浓缩，用0-15％EtOAc-己烷洗脱进行色谱法，得到产物；
5）在0℃向步骤5 的产物在DCM中的溶液中，一次性快速加入AlCl3，并将所得混合物在室温搅拌过夜。将反应混合物用饱和罗谢尔盐水溶液停止反应，将两相反应混合物在室温下搅拌1小时；分离有机相，将水层用DCM萃取3次；将合并的有机层然后用水和盐水洗涤，过滤，并浓缩；然后将剩余物通过硅胶上的柱色谱法(用己烷/EtOAc 99∶ 1～60∶40洗脱)纯化，得到产物；
6）在微波小瓶中，向步骤5的产物的MeOH溶液中加入N-Boc-4-氧代-L-脯氨酸甲酯、和吡咯烷；然后向其中加入分子筛(4A珠)，将反应加热至105℃并在BIOTOPE INITIATOR微波反应器中在非常高的吸光度下搅拌30分钟；将反应冷却至室温，滤出分子筛；减压蒸发溶剂；将粗制的橙色油通过柱色谱法，在ANA-LOGIX使用硅胶柱，经30分钟的过程用己烷/丙酮(0-50％)洗脱进行纯化，得到产物，为非对映异构体的混合物；
7）将步骤6的产物的溶液溶于THF和MeOH的混合物中；将混合物冷却至0℃，并搅拌15分钟。然后向该反应中加入NaBH4，并在0℃搅拌混合物30分钟；然后将反应在室温搅拌1小时；将溶剂用EtOAc稀释并在室温用NH4Cl水溶液停止反应；将有机级分用1mNaOH、盐水、水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤，减压蒸发溶剂；粗制的黄色固体产物用于下一步骤；
8）将步骤7的产物和TEA加入到DCM中；然后加入MsCl到该溶液中，并使其在N2下搅拌过夜；然后将反应用饱和NH4Cl停止反应，将混合物用DCM萃取；将合并的有机级分用水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤，在减压下蒸发溶剂，得到产物；
9）将步骤8的产物加入到搅拌冷却的EtOAc的室温溶液中；加入Pd/C，在排空和用H2回填后，在连接到H2- 填充的气球下将反应在室温搅拌30分钟；将反应混合物用DCM稀释，将该悬浮液通过硅藻土垫过滤；将不溶物用DCM 进一步洗涤，真空浓缩滤液，得到产物；
10）在室温将步骤9的产物于4N HCl二噁烷溶液中的溶液搅拌1小时，用甲苯蒸发2次，用乙醚蒸发2次，得到胺盐酸盐，就这样用于下一步骤。将胺盐、(S)-2-( 叔丁氧基羰基氨基)壬-8-烯酸、HATU和TEA于DMF中的浆液在室温搅拌过夜。将反应混合物用水稀释，用EtOAc萃取3次。将合并的有机层用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤，浓缩，用0-50-100％EtOAc- 己烷进行层析，得到产物；
11）在60 ℃将步骤10产物和LiOH·H2O于THF、MeOH和水中的混合物搅拌1小时；然后将反应冷却，用水稀释，用1N HCl 酸化，用EtOAc 萃取3次；将合并的有机层用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤并蒸发至干，得到粗酸产物；
12）向步骤11的产物、(1R，2S)-1- 氨基-N-(1- 甲基环丙基磺酰基)-2- 乙烯基环丙烷甲酰胺、和HATU于DMF的搅拌溶液中，加入TEA并进行搅拌；将混合物在室温搅拌过夜；该混合物用Et2O稀释，用水洗涤，用Et2O回萃取；将合并的有机物干燥(Na2SO4)，过滤，减压蒸发溶剂；粗品黄色油状物通过柱色谱法纯化，用己烷/EtOAc(0％～95％ ) 洗脱，得到产物，为黄色固体；
13）将步骤12 的产物、Zhan 催化剂和1，4-苯醌的DCE溶液在保持75℃的油浴中搅拌。在反应混合物冷却至室温后，加入丁基乙烯基醚停止反应，真空除去挥发物，将得到的暗绿色/棕色剩余物直接通过柱30％丙酮/己烷纯化，得到(2R，6S，13aS，14aR，16aS，Z)-14a-(1-甲基环丙基磺酰基氨基甲酰基)-5，16-二氧代-5′ -(三氟甲基)-1′，2′，3，5，6，7，8，9，10，11，13a，14，14a，15，16，16a-十六氢-1H-螺[环丙并[e]吡咯并[1，2-a][1，4]二氮杂环十五碳烯-2，3′ -吡喃并[2，3-c]喹啉]-6-基氨基甲酸叔丁酯)。
本发明的优点和有益效果在于：本发明一种蛋白酶抑制剂的制备方法，该方法获得的蛋白酶抑制剂可用于抑制HCV( 丙型肝炎病毒)NS3蛋白酶、预防或治疗一种或多种HCV 感染的症状。
附图说明
图1为本发明的流程图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
实施例：
一种蛋白酶抑制剂的制备方法，包括以下步骤：
1）将3- 羟基喹啉-4- 甲酸(10g，52.9mmol) 的THF(320ml) 溶液用NBS(17.88g，100mmol) 处理，并在室温搅拌2.5 小时。该反应混合物然后用EtOAc 萃取，用水随后用Na2S2O3水溶液洗涤。将合并的有机层用Na 2SO4干燥和浓缩，得到中间体产物。
2）在0℃向步骤1 的粗产物(18.5g，61.1mmol) 在MeOH(40ml) 中的溶液中，加入甲苯(200ml) 和( 三甲基甲硅烷基) 重氮甲烷(TMSCHN2；61.1ml，122mmol) 并搅拌。将反应混合物升温至室温并搅拌30 分钟。粗LC-MS 显示出起始材料全部消耗。将AcOH(3ml) 加入到反应混合物中，直到鼓泡停止。蒸发有机物，将粗残留物溶于甲苯并蒸发，得到为棕色固体的粗产物，使用(0-5)％ EtOAc- 己烷作为流动相将其通过硅胶柱色谱法进行纯化，得到纯的中间体产物(12g，37.9mmol，62.0％产率)。
3）向步骤2 的产物(6g，18.93mmol) 在DMF(32ml) 中溶液中，加入Cu-I(1.803g，9.46mmol)，接着加入MFSDA(7.22ml，56.8mmol)。然后在微波高吸光度下将反应混合物中在100℃加热30 分钟。将反应用EtOAc 稀释，用盐水和水洗涤。将有机物用Na2SO4干燥，浓缩并用40％己烷/EtOAc 进行纯化，得到中间体产物(2.72g，8.89mmol，46.9％产率)。
4）将步骤3 的产物(2.72g，8.89mmol)、三丁基(1- 乙氧基乙烯基) 锡(6.00ml，
17.77mmol) 和Pd(PPh3)4(0.513g，0.444mmol) 于二噁烷(40ml) 中的混合物在回流下加热过夜。将反应混合物冷却至室温，加入～ 10ml 1N HCl，并在室温搅拌90 分钟。反应混合物然后用水稀释，用DCM 萃取3 次。将合并的有机层用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤，浓缩，用0-15％ EtOAc- 己烷洗脱进行色谱法，得到产物(1.3g，4.83mmol，54.3％产率)。
5）在0℃向步骤5 的产物(1.3g，4.83mmol) 在DCM(50ml) 中的溶液中，一次性快速加入AlCl3(5.79g，43.5mmol)，并将所得混合物在室温搅拌过夜。将反应混合物用饱和罗谢尔盐(Rochelle′ s salt)( 水性) 水溶液停止反应，将两相反应混合物在室温下搅拌1 小时。分离有机相，将水层用DCM 萃取3 次。将合并的有机层然后用水和盐水洗涤，过滤，并浓缩。然后将剩余物通过硅胶上的柱色谱法( 用己烷/EtOAc 99 ∶ 1 ～ 60 ∶ 40 洗脱) 纯化，得到产物(310mg，1.215mmol，25.2％产率)。
6）在微波小瓶中，向步骤5 的产物(0.310g，1.215mmol) 的MeOH(4ml) 溶液中加入N-Boc-4- 氧代-L- 脯氨酸甲酯(0.591g，2.430mmol)、和吡咯烷(0.039ml，0.486mmol)。然后向其中加入分子筛(4A 珠)，将反应加热至105℃并在BIOTOPE INITIATOR 微波反应器中在非常高的吸光度下搅拌30 分钟。将反应冷却至室温，滤出分子筛。减压蒸发溶剂。将粗制的橙色油通过柱色谱法，在ANA-LOGIX 使用硅胶柱，经30 分钟的过程用己烷/ 丙酮(0-50％ ) 洗脱进行纯化，得到产物(565mg，1.176mmol，97％产率)，为非对映异构体的混合物。
7）将步骤6 的产物(565mg，1.176mmol) 的溶液溶于THF(10ml) 和MeOH(10ml) 的混合物中。将混合物冷却至0℃，并搅拌15 分钟。然后向该反应中加入NaBH4(57.8mg，1.529mmol)，并在0℃搅拌混合物30 分钟。然后将反应在室温搅拌1 小时。将溶剂用EtOAc 稀释并在室温用NH4Cl 水溶液停止反应。将有机级分用1m NaOH、盐水、水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤，减压蒸发溶剂。粗制的黄色固体产物(567mg，1.175mmol，100％产率) 用于下一步骤。
8）将步骤7 的产物(567mg，1.175mmol) 和TEA(0.490ml，3.53mmol) 加入到DCM(6ml)中。然后加入MsCl(0.136ml，1.763mmol) 到该溶液中，并使其在N2下搅拌过夜。然后将反应用饱和NH4Cl 停止反应，将混合物用DCM(3 x 10mL) 萃取。将合并的有机级分用水洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤，在减压下蒸发溶剂，得到产物(282mg，0.607mmol，51.7％产率)。
9）将步骤8 的产物(282mg，0.607mmol) 加入到搅拌冷却的EtOAc 的室温溶液(8ml)中。加入Pd/C(36mg，0.034mmol)，在排空和用H2回填后，在连接到H 2- 填充的气球下将反应在室温搅拌30 分钟。将反应混合物用DCM(15mL) 稀释，将该悬浮液通过硅藻土垫过滤。将不溶物用DCM 进一步洗涤，真空浓缩滤液，得到产物(280mg，0.600mmol，99％产率)。
10）在室温将步骤9的产物(280mg，0.600mmol)于4N HCl二噁烷溶液(30ml) 中的溶液搅拌1小时，用甲苯蒸发2次，用乙醚蒸发2次，得到胺盐酸盐(230mg，0.571mmol，95％产率)，就这样用于下一步骤。将胺盐(230mg，0.571mmol)、(S)-2-( 叔丁氧基羰基氨基)壬-8- 烯酸(388mg，0.857mmol)、HATU(326mg，0.857mmol) 和TEA(0.239ml，1.713mmol)于DMF(7ml)中的浆液在室温搅拌过夜。将反应混合物用水稀释，用EtOAc 萃取3 次。将合并的有机层用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤，浓缩，用0-50-100％ EtOAc-己烷进行层析，得到产物(156mg，0.252mmol，44.1％产率)。
11）在60 ℃ 将步骤10）产物(156mg，0.252mmol) 和LiOH·H2O(42.3mg，1.007mmol) 于THF(1ml)、MeOH(1ml) 和水(0.7ml) 中的混合物搅拌1 小时。然后将反应冷却，用水稀释，用1N HCl 酸化，用EtOAc 萃取3 次。将合并的有机层用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤并蒸发至干，得到粗酸产物(130mg，0.215mmol，85％产率)。
12）向步骤11 的产物(130mg，0.215mmol)、(1R，2S)-1- 氨基-N-(1- 甲基环丙基磺酰基)-2- 乙烯基环丙烷甲酰胺(79mg，0.322mmol)、和HATU(122mg，0.322mmol) 于DMF(2.5ml) 的搅拌溶液中，加入TEA(0.09ml，0.64mmol) 并进行搅拌。将混合物在室温搅拌过夜。该混合物用Et2O(20mL) 稀释，用水(15ml) 洗涤，用Et2O(20ml) 回萃取。将合并的有机物干燥(Na2SO4)，过滤，减压蒸发溶剂。粗品黄色油状物通过柱色谱法纯化，用己烷/EtOAc(0％～ 95％ ) 洗脱，得到产物(82mg，0.099mmol，45.9％产率)，为黄色固体。
13）将步骤12 的产物(86mg，0.103mmol)、Zhan 催化剂(Zhan ′ s catalyst，詹氏催化剂)(18.96mg，0.026mmol) 和1，4- 苯醌(3.35mg，0.031mmol) 的DCE(35ml) 溶液在保持75℃的油浴中搅拌。在反应混合物冷却至室温后，加入丁基乙烯基醚(0.5ml)停止反应，真空除去挥发物，将得到的暗绿色/ 棕色剩余物直接通过柱30％丙酮/ 己烷(ANALOGIX) 纯化，得到(2R，6S，13aS，14aR，16aS，Z)-14a-(1-甲基环丙基磺酰基氨基甲酰基)-5，16-二氧代-5′ -(三氟甲基)-1′，2′，3，5，6，7，8，9，10，11，13a，14，14a，15，16，16a-十六氢-1H-螺[环丙并[e]吡咯并[1，2-a][1，4]二氮杂环十五碳烯-2，3′ -吡喃并[2，3-c]喹啉]-6-基氨基甲酸叔丁酯(61mg，0.076mmol，73.4％产率)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。