用重组大麦条斑花叶病毒载体介导的小麦靶标miRNA过表达方法与流程

本发明涉及一种用重组大麦条斑花叶病毒(BSMV)介导的小麦内源靶标miRNA过量表达的方法，利用该方法能够研究小麦内源miRNA在小麦生长发育或响应逆境中的生物学作用。

背景技术：

近年来，大量研究发现在生物体内存在的miRNA是一类内源的长度为18-24个核苷酸的小的非编码RNA，它是由生物体内源基因转录加工而成的具有茎环结构的长的单链RNA前体(pre-miRNA)产生的(Chen 2009；Bartel2004)。植物内源miRNA能与其序列互补的mRNA结合，通过序列切割或抑制序列翻译的方式抑制靶标mRNA表达，是强有力的转录后调节子；参与调控植物的生长和发育以及植物对生物逆境和非生物逆境的响应(Chen 2004；Sunkar et al.2006；Xue et al.2009；Xin et al.2010；Kantar et al.2011；Wang et al.2011)。植物中的第1个miRNA是在拟南芥中被发现的(Llave et al.,2002)；至今，在miRNA公共数据库(miRBase，Release 21.0,June,2014；http://www.mirbase.org)中注册的miRNA有从约73种植物中鉴定出的大约8496个miRNA。然而，这些miRNA中生物学功能已研究清楚的miRNA数目非常有限；而且其中大多数是来自模式植物拟南芥、水稻和西红柿(Schommer et al.,2012；Zhang et al.,2013)。在模式植物拟南芥和水稻中建立了2种反向遗传学策略用于特定miRNA的功能研究。一种策略是转基因过表达加强特定miRNA活性(Allen et al.,2007；Zhang et al.,2013)；另一种方法是通过特定miRNA基因突变(Baker et al.,2005)或表达抗特定miRNA的靶标(即靶标基因的沉默突变)(Zhao et al.,2007)、特定miRNA仿靶标(MTM)(Franco-Zorrilla et al.,2007)、或短的串联仿靶标(STTM)(Yan et al.,2012)以阻断特定miRNA活性。而这些策略都依赖于植物转基因和稳定的转基因植株产生，因而限制了其在遗传转化频率低的物种或高通量分析中的应用。世界上最重要的粮食作物之一—异源六倍体普通小麦(Triticum aestivum L.,AABBDD；2n＝6×＝42)具有庞大而复杂的基因组，加之，其遗传转化率很低；构建突变体库需要转化子的数目非常庞大，在模式植物中建立的miRNA功能研究策略无法应用于重要粮食作物小麦。目前，在小麦中尚缺乏用于miRNA功能研究的切实可行的有效方法。

近年来，建立和发展的病毒诱导的内源靶基因沉默(virus-induced gene silencing，VIGS)方法可以通过在一些植物中瞬时创建蛋白编码基因抑制的表型，已逐渐成为蛋白编码基因功能鉴定的有效工具。迄今，适用于粮食作物小麦VIGS的病毒载体仅有大麦条斑花叶病毒(the Barley stripe mosaic virus，BSMV)载体，它由α、β、γ3条RNA正链组成；经过改造的重组BSMV载体已被用于小麦蛋白编码基因的沉默及功能鉴定(Scofield et al.,2005；Ma et al.2012)。但迄今，尚没有关于小麦内源小的非编码miRNA的过量表达技术方法的报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于，提供一种用重组大麦条斑花叶病毒(BSMV)介导的小麦内源靶标miRNA过量表达的方法。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案予以实现：

第一种技术方案：

一种用重组大麦条斑花叶病毒介导的小麦靶标miRNA过表达方法，其特征在于，将携带小麦PDS基因的人工miRNA(ami-PDS)前体片段的重组BSMV的α、β、γ_Pre-amiR-PDS cDNA的体外转录物等量混合后接种小麦；接种部位为小麦3-5叶期幼苗完全展开新叶或小麦扬花期穗部，接种方法为用拇指和食指上下摩擦3-5次；然后观察因ami-PDS过量表达而导致PDS基因表达被抑制的光漂白或退绿表型。

第二种技术方案：

一种用重组BSMV病毒介导小麦内源靶标miRNA过量表达的方法，其特征在于，将携带小麦miRNA156前体(pre-miR156)片段的重组BSMV的α、β、γ_pre-miRNA cDNA的体外转录物等量混合后接种小麦，接种部位为小麦3-5叶期幼苗完全展开新叶或小麦扬花期穗部，接种方法为用拇指和食指上下摩擦3-5次；然后用本领域共知的Quantitative real-time RT-PCR(qTR-PCR)方法检测接种小麦植株内源miR156过量表达水平以及miR156的靶基因表达(mRNA)水平。

所述的第二种技术方案具体按下列步骤进行：

(a)构建携带小麦miR56前体片段的重组BSMV的γ_pre-miR156cDNA；

(b)按照所述接种部位和接种方法，用BSMV的α、β、γ_pre-miR156cDNA的体外转录物等量混合接种小麦，实现小麦内源miR56过表达。

采用本发明的用重组大麦条斑花叶病毒介导的小麦靶标miRNA过表达方法，经申请人验证证明具有的创新和技术效果如下：

1、与通过小麦转基因过表达miRNA技术相比，采用本发明的用重组大麦条斑花叶病毒(BSMV)介导的小麦靶miRNA过表达方法，无需进行小麦的遗传转化(小麦的遗传转化率非常低)，只需用携带靶miRNA前体片段的重组BSMV病毒的α、β、γcDNA的体外转录物在3-5叶期小麦幼苗完全展开新叶或抽穗期～扬花期的小麦穗部摩擦接种，就可以实现靶标miRNA的有效沉默，能快速创制靶标miRNA过量表达的表型。其操作简单，省时省力，大大缩短了获得小麦内源靶标基因过量表达表型的周期。

2、与现有利用重组BSMV病毒介导的小麦靶基因沉默技术相比，本发明采用构建携带本领域公知的小麦PDS基因人工miRNA前体(Pre-amiR-PDS)片段的重组病毒BSMV，在3-5叶期小麦幼苗完全展开新叶或抽穗期～扬花期的小麦穗部摩擦3-5次进行接种，接种13天后在小麦新生叶片出现光漂白(退绿)的表型，即为人工miRNA(amiR-PDS)过量表达导致小麦内源PDS基因表达抑制(mRNA水平下降)的表型；这种光漂白(退绿)的表型可持续至接种后35天。

3、首次利用人工amiR-PDS作为标记基因，利用重组BSMV的α、β、γ_Pre-amiR-PDS cDNA的体外转录物在3-5叶期小麦幼苗完全展开新叶摩擦接种，实现了小麦植株amiR-PDS的过量表达。

4、首次构建了携带小麦内源miR56前体(pre-miR156)片段的重组病毒BSMV：miR56-F和BSMV：miR56-R；利用本发明建立的上述小麦目标miRNA过表达的方法，实现了小麦内源靶miR56的过量表达。

因此，本发明的用重组大麦条斑花叶病毒介导的小麦靶标miRNA过表达方法，可以用于快速有效地鉴定与小麦生长和发育相关miRNA(涉及产量和品质性状)的功能。

附图说明

图1是大麦条斑花叶病毒(BSMV)和重组BSMV的γ载体的插图片段的结构图。

其中，A图是大麦条斑花叶病毒(BSMV)的α、β、γcDNA结构图；图中矩形框表示开放阅读框，框中的符号表示基因名称；TACS表示TA克隆位点；

B图是用于小麦内源miRNA156(miR156)过量表达的重组BSMVγ载体的插入基因片段；图中Ins表示插入片段；

C图是用于小麦PDS基因的人工miRNA(amiR-PDS)过表达的重组BSMVγ载体的插入片段(即amiR-PDS前体，简写为：Pre-amiR-PDS)；图中amiR-PDS*是amiR-PDS的互补序列。

图2是展示重组BSMV病毒介导的小麦叶片过量表达PDS基因的人工miRNA(amiR-PDS)导致叶片光漂白(PDS沉默)的表型。在4叶期小麦幼苗的第3叶接种携带小麦PDS基因人工miRNA前体(Pre-amiR-PDS)的重组BSMV(BSMV：amiR-PDS)后第18天小麦植株新生叶片PDS基因表达被抑制的表型(光漂白或退绿表型)。

图3是重组BSMV病毒BSMV：miR156介导的小麦植株内源miR156过量表达。其中：

A图是在4叶期小麦幼苗的第3叶接种携带miR156前体(pre-miR156)片段的重组BSMV(BSMV：miR156)后第18天小麦植株新生叶片的表型；

B图是Stem-loop RT-PCR检测表明BSMV：miR156接种植株比对照植株(BSMV：00)新生叶片(A图叶片)内源miR56水平极显著提高，表明内源miR156过量表达；

C图是qRT-PCR测定表明A图叶片中miR56靶基因mRNA水平显著降低，也说明内源miR156过量表达。

图4是BSMV:miR156介导小麦植株内源miR156过量表达导致植株由营养生长向生殖生长转化延缓的2种表型。A图和B图分别为用重组BSMV病毒BSMV:miR156接种小麦叶片后第28天(dpi)植株呈现的两种表型(表型Ⅰ和Ⅱ)的照片。与接种BSMV:00(对照)植株相比，接种BSMV:miR156植株不抽穗(表型Ⅰ)或抽穗时间推迟(表型Ⅱ)；C图是接种BSMV:miR156植株在接种后第40天的植株表型Ⅰ照片；D图是Stem-loop RT-PCR检测结果表明接种BSMV:miR156的植株(图A和图B植株)的miR56水平显著增加。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。

具体实施方式

按照本发明的第一种技术方案：

一种用重组大麦条斑花叶病毒介导的小麦靶标miRNA过表达方法，将携带小麦PDS基因的人工miRNA(ami-PDS)前体片段的重组BSMV的α、β、γ_Pre-amiR-PDS cDNA的体外转录物等量混合后接种小麦；接种部位为小麦3-5叶期幼苗完全展开新叶或小麦扬花期穗部，接种方法为用拇指和食指上下摩擦3-5次；然后观察因ami-PDS过量表达而导致PDS基因表达被抑制的光漂白或退绿表型。

按照本发明的第二种技术方案：

一种用重组大麦条斑花叶病毒介导的小麦靶标miRNA过表达方法，将携带小麦miR56前体片段(pre-miR156)的重组BSMV的α、β、γ_pre-miR156 cDNA的体外转录物等量混合后接种小麦，接种部位为小麦3-5叶期幼苗完全展开新叶或小麦扬花期穗部，接种方法为用拇指和食指上下摩擦3-5次；然后用本领域公知的Quantitative real-time RT-PCR方法检测接种小麦植株内源miR156的过量表达水平以及miR156靶基因表达(mRNA)被抑制的水平。

具体的实现步骤是：

(a)构建携带小麦miR56前体片段的重组BSMV的γ_pre-miR156 cDNA；

(b)按照所述接种部位和接种方法，用BSMV的α、β、γ_pre-miR156 cDNA的体外转录物等量混合接种小麦，实现小麦内源miR56过表达。

需要说明的是，下列实施中所有方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1：

申请人采用携带人工miRNA前体序列(Pre-amiR-PDS)片段的重组病毒BSMV对本发明的方法进行验证，具体方法是：

首先，申请人用本领域共知的PCR方法构建重组BSMV(BSMV：amiR-PDS)的γ_pre-amiR-PDS cDNA；

其次，用本领域共知的体外转录方法转录BSMV的α、β、γ_pre-amiR-PDS cDNA获得α、β、γ_PDSRNA；

然后，取α、β、γ_pre-amiR-PDS RNA各300ng，分别与25μl的FES Buffer(含1％重量的甘氨酸、0.75％重量的K₂HPO₄、1％重量的硅藻土、1％重量的澎润土、1％重量的Na₃PO₄.10H₂O)于拇指和食指尖间混合均匀；

最后，在小麦3-5叶期幼苗完全展开新叶或扬花期小麦穗部上下轻轻摩擦3-5次。

13天后即可观察到小麦新生叶片光漂白(退绿)的表型，即内源PDS基因表达被抑制的表型，这种表型可持续至接种后35天。

可以预见，按照本发明所述的用重组大麦条斑花叶病毒介导的小麦靶标miRNA过表达方法，可以实现小麦叶片任何miRNA的过量表达。

附图1显示出：大麦条斑花叶病毒(BSMV)的α、β、γcDNA结构；图中矩形框表示开放阅读框，框中的符号表示基因名称；TACS表示TA克隆位点(A图)；用于小麦内源miRNA156(miR156)过表达的重组BSMV的γ载体的插入基因片段；图中Ins表示插入片段(B图)；用于小麦PDS基因的人工miRNA(amiR-PDS)过表达的重组BSMV的γ中插入片段；图中amiR-PDS*是amiR-PDS的互补序列(C图)。

图2展示了重组病毒BSMV：amiR-PDS介导的小麦叶片过量表达PDS基因的人工miRNA(amiR-PDS)导致叶片光漂白(退绿)表型的照片；在4叶期小麦幼苗的完全展开新叶接种携带小麦PDS基因人工miRNA前体的重组病毒BSMV：amiR-PDS，接种后第18天小麦植株新生叶片光漂白(退绿)表型的照片。

实施例2：

申请人构建了携带小麦内源miR56前体pre-miR156序列片段的重组γ_pre-miR156cDNA。构建方法如下：

申请人根据本领域公知的小麦miR56初级转录本pri-miR156(Genbank登录号为CL902915)和pre-miR56序列((Scoles et al.,2008)，设计了上游引物和下游引物，其中：

上游引物：5'-CGCTTCGGCTCCTCTCTCTCT-3'；

下游引物：5'-CGGACAAGATAGGGCTGAGGT-3'；

用本领域公知的CTAB方法提取小麦基因组DNA，并以基因组DNA为模板，通过本领域公知的PCR扩增方法，得到miR56前体(pre-miR156)序列片段。

将该片段连接到线性化的BSMV的γcDNA质粒(Ma et al.，2012)，即得到γ_pre-miR156cDNA。通过本领域公知的方法体外转录BSMV的α、β、γ_pre-miR156cDNA获得3种转录子α、β、γ_pre-miR156RNA，分别取α、β、γ_1Bx14RNA各300ng，与25μl的FES Buffer(配方为：1％重量的甘氨酸、0.75％重量的K₂HPO₄、1％重量的硅藻土、1％重量的澎润土、1％重量的Na₃PO₄.10H₂O)于拇指和食指尖间混合均匀；然后，在4叶期小麦幼苗的第3片完全展开叶轻轻摩擦3-5次；接种后第18天，用本领域公知的Quantitative real-timeRT-PCR(qTR-PCR)方法检测接种小麦植株新生叶片内源目标miR156的表达水平以及miR156靶基因SPL2(Genbank登录号CK196549)的mRNA水平。

本实施例实现了小麦植株内源靶标miR156的过量表达，导致miR156靶基因SPL2表达被极显著抑制，进而导致小麦植株产生由营养生长向生殖生长转化延缓，抽穗和开花时间严重推后的表型。

图3显示了重组病毒BSMV介导的小麦植株内源miR156过表达的情况：

A图：在4叶期小麦幼苗的完全展开的第3叶片接种携带miR156前体(pre-miR156)片段的重组BSMV(BSMV：miR156-F和BSMV：miR156-R)，接种后第18天小麦植株新生叶片的表型。

B图：Stem-loop RT-PCR检测表明BSMV：miR156接种植株比对照植株(BSMV：00)新生叶片(A图叶片)内源miR56水平极显著提高，表明内源miR156过量表达。

C图：qRT-PCR测定表明A图叶片中miR56靶基因mRNA水平显著降低，也说明内源miR156过量表达。

图4显示了重组病毒BSMV:miR156介导小麦植株内源miR156过量表达导致植株由营养生长向生殖生长转化延缓的2种表型。

A图和B图分别为用重组BSMV病毒BSMV:miR156-F和BSMV:miR156-R接种小麦叶片后第28天(dpi)植株呈现的两种表型(表型Ⅰ和Ⅱ)的照片。与对照植株(接种BSMV:00)相比，接种BSMV:miR156植株不抽穗(表型Ⅰ)或抽穗时间推迟(表型Ⅱ)；

C图是接种BSMV:miR156植株在接种后第40天的植株不抽穗(表型Ⅰ)照片；

D图是Stem-loop RT-PCR检测结果表明接种BSMV:miR156的植株(图A和图B植株)的miR56水平显著增加。

综上所述，采用本发明的用重组大麦条斑花叶病毒介导的小麦靶标miRNA过表达方法，具有简单、快速、准确、可重复性好的特点，在小麦植株生长期就可以实现内源靶miRNA的瞬时过表达，快速创制靶miRNA过量表达的表型，以分析靶miRNA的生物学功能。

核苷酸或氨基酸序列表

<110>西北农林科技大学

<120>用重组大麦条斑花叶病毒载体介导的小麦靶标miRNA过表达方法

<160>

<210>1

<211>21

<212>上游引物

<213>

<220>

<400>1

5'-CGCTTCGGCTCCTCTCTCTCT-3'

<210>1

<211>21

<212>下游引物

<213>

<220>

<400>1

5'-CGGACAAGATAGGGCTGAGGT-3'

核苷酸或氨基酸序列表

<110> 西北农林科技大学

<120>用重组大麦条斑花叶病毒载体介导的小麦靶标miRNA过表达方法

<160>

<210> 1

<211> 21

<212> 上游引物

<213>

<220>

<400> 1

5'- CGCTTCGGCTCCTCTCTCTCT-3'

<210> 1

<211> 21

<212> 下游引物

<213>

<220>

<400> 1

5'- CGGACAAGATAGGGCTGAGGT-3'