本发明涉及中药提取领域，涉及一种睡茄交酯类化合物、提取方法及应用。
背景技术：
苦蘵(physalisangulatal.)，又称灯笼草、天泡子、天泡草、朴朴草、打额泡等，为茄科(solanaceae)酸浆属(physalis)一年生草本植物。《陆川本草》和《中华本草》对苦蘵的药用功效有着详细的记载，苦蘵具有行气，消胀，利尿，治腹胀，清热解毒，利尿止血，消肿散结，可用于治疗咽喉肿痛，肺痈，腮腺炎；小便不利，血尿牙龈肿痛，天疱疮等疾病。民间多用于治疗疱疮、牙龈肿痛、湿热黄疸、咽喉红肿疼痛、肺热咳嗽等疾病。国内外学者通过体内、体外实验证实了苦蘵的抗炎(choi,e.m.；etal.investigationsofanti-inflammatoryandantinociceptiveactivitiesofpipercubeba,physalisangulataandrosahybrida.journalofethnopharmacology2003,89,171–175.)、抗肿瘤(he,h.；etal.physalinainducesapoptoticcelldeathandprotectiveautophagyinht1080humanfibrosarcomacells.journalofnaturalproducts,2013,76,880–888.)、抗菌(silva,m.t.g.；etal.studiesonantimicrobialactivity,invitro,ofphysalisangulatal.(solanaceae)fractionandphysalinbbringingouttheimportanceofassaydetermination.memoriasdoinstitutooswaldocruz2005,100,779–782.)、抗氧化(choi,e.m.；etal.effectofsomemedicinalplantsonplasmaantioxidantsystemandlipidlevelsinrats.phytotherapyresearch.2005,19,382-386.)等作用。
但从苦蘵中提取睡茄交酯类化合物、提取方法及应用尚未见报道。
技术实现要素：
本发明的目的是提供睡茄交酯类化合物。
本发明的第二个目的是提供睡茄交酯类化合物的提取方法。
本发明的第三个目的是提供睡茄交酯类化合物的应用。
本发明的第四个目的是提供包含权利要求1和2的睡茄交酯类化合物的苦蘵提取物。
本发明的第五个目的是提供苦蘵提取物的应用。
本发明的第六个目的是提供含睡茄交酯类化合物的药物组合物。
本发明的第七个目的是提供上述药物组合物的应用。
本发明的技术方案概述如下：
睡茄交酯类化合物，具有式(i)的结构：
其中：
r1为oh或och3；
r2为oh或h；
r3为oh或oac；
r4为h；r5为h或oh；或r4和r5为
r6为h或oh。
上述化合物，优选的结构式为：
上述化合物的提取方法，包括如下步骤：
(1)以苦蘵的干燥茎叶为原料，加入原料8-10质量倍的体积分数为60％-80％乙醇水溶液，回流提取2-3次，每次提取2-3小时，合并得到提取液，减压回收溶剂，浓缩后得到总浸膏；
(2)将总浸膏分散到5-10质量倍的水中，依次用石油醚和乙酸乙酯进行萃取，乙酸乙酯萃取液减压回收溶剂，得到乙酸乙酯层浸膏；
(3)乙酸乙酯层浸膏经硅胶柱色谱分离，以体积比分别为100:1、50:1、30:1和15:1的二氯甲烷－甲醇为洗脱剂梯度洗脱，得到馏分fr.1、fr.2、fr.3和fr.4；
(4)馏分fr.3经硅胶柱色谱分离，以体积比分别为10:1、8:1和6:1的石油醚－丙酮为洗脱剂梯度洗脱，得到馏分fr.3-1、fr.3-2、fr.3-3；
(5)馏分fr.3-3经sephadexlh-20柱色谱分离，以体积比为1:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂等度洗脱，得到馏分fr.3-3-1和fr.3-3-2；
(6)馏分fr.3-3-2经ods柱色谱分离，以体积比为1:9、3:7、5:5和8:2的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，得到馏分fr.3-3-2-1、fr.3-3-2-2、fr.3-3-2-3和fr.3-3-2-4；
(7)馏分fr.3-3-2-4经硅胶制备薄层色谱分离，以体积比为1:1的二氯甲烷－丙酮为展开剂进行制备，得到化合物2；
(8)馏分fr.4经硅胶柱色谱分离，以体积比为80:1、40:1、20:1、10:1和5:1的氯仿－丙酮为洗脱剂梯度洗脱，得到馏分fr.4-1、fr.4-2、fr.4-3、fr.4-4和fr.4-5；
(9)馏分fr.4-2经制备hplc色谱，以体积比为7:3的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到化合物4；
(10)馏分fr.4-4经制备hplc色谱，以体积比为7:3的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到化合物5；
(11)馏分fr.4-5经ods柱色谱分离，以体积比为7:3的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到馏分fr.4-5-1、fr.4-5-2；
(12)馏分fr.4-5-2经制备hplc色谱，以体积比为7:3的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到化合物1和化合物3。
睡茄交酯类化合物在制备抑制细胞释放no药物中的应用。
包含睡茄交酯类的苦蘵提取物。
苦蘵提取物在制备抑制细胞释放no药物中的应用。
一种药物组合物，是包含睡茄交酯类化合物或其药学上可接受的盐，和药学上可接受的载体和/或赋形剂。
上述药物组合物在制备抑制细胞释放no药物中的应用。
本发明的优点：
本发明的睡茄交酯类化合物能有效地抑制一氧化氮(no)的释放，提示本发明化合物可作为抗炎的药物。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行描述，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
睡茄交酯类化合物的提取方法，包括如下步骤：
(1)以苦蘵(physalisangulatal.)的干燥茎叶(9.5kg)为原料，加入原料9质量倍的体积分数为75％乙醇水溶液，回流提取2次，每次提取2小时，合并得到提取液，减压回收溶剂，浓缩后得到总浸膏(1370g)；
(2)将总浸膏分散到5质量倍的水中，依次用等体积石油醚和乙酸乙酯进行萃取，乙酸乙酯萃取液减压回收溶剂，得到乙酸乙酯层浸膏116g；
(3)乙酸乙酯层浸膏经硅胶柱色谱分离，以体积比分别为100:1、50:1、30:1和15:1的二氯甲烷－甲醇为洗脱剂梯度洗脱，得到馏分fr.1、fr.2、fr.3(35g)和fr.4(15g)；
(4)馏分fr.3经硅胶柱色谱分离，以体积比分别为10:1、8:1和6:1的石油醚－丙酮为洗脱剂梯度洗脱，得到馏分fr.3-1、fr.3-2、fr.3-3(4.2g)；
(5)馏分fr.3-3经sephadexlh-20柱色谱分离，以体积比为1:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂等度洗脱，得到馏分fr.3-3-1和fr.3-3-2(600mg)；
(6)馏分fr.3-3-2经ods柱色谱分离，以体积比为1:9、3:7、5:5和8:2的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，得到馏分fr.3-3-2-1、fr.3-3-2-2、fr.3-3-2-3和fr.3-3-2-4(500mg)；
(7)馏分fr.3-3-2-4经硅胶制备薄层色谱分离，以体积比为1:1的二氯甲烷－丙酮为展开剂进行制备，得到化合物2(8mg)；
(8)馏分fr.4经硅胶柱色谱分离，以体积比为80:1、40:1、20:1、10:1和5:1的氯仿－丙酮为洗脱剂梯度洗脱，得到馏分fr.4-1、fr.4-2(2g)、fr.4-3、fr.4-4(1.5g)和fr.4-5(1.7g)；
(9)馏分fr.4-2经制备hplc色谱，以体积比为7:3的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到化合物4(19mg)；
(10)馏分fr.4-4经制备hplc色谱，以体积比为7:3的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到化合物5(4mg)；
(11)馏分fr.4-5经ods柱色谱分离，以体积比为7:3的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到馏分fr.4-5-1、fr.4-5-2(800mg)；
(12)馏分fr.4-5-2经制备hplc色谱，以体积比为7:3的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到化合物1(19mg)和化合物3(6mg)。
各化合物的物理化学和常数如下：
化合物1：无定型粉末；
化合物2：无定型粉末；
化合物3：无定型粉末；
化合物4：无定型粉末
化合物5：无定型粉末；
表1化合物1-5氢谱数据
注：a，400mhz，pyridine-d5。
表2化合物1-5的碳谱数据
注：a，400mhz，pyridine-d5。
各化合物的结构为：
实施例2
睡茄交酯类化合物的提取方法，包括如下步骤：
(1)以苦蘵的干燥茎叶为原料，加入原料8质量倍的体积分数为80％乙醇水溶液，回流提取3次，每次提取2小时，合并得到提取液，减压回收溶剂，浓缩后得到总浸膏；
(2)将总浸膏分散到5质量倍的水中，依次用等体积石油醚和乙酸乙酯进行萃取，乙酸乙酯萃取液减压回收溶剂，得到乙酸乙酯层浸膏；
(3)-(12)同实施例1(3)-(12)。
实施例3
睡茄交酯类化合物的提取方法，包括如下步骤：
(1)以苦蘵的干燥茎叶为原料，加入原料10质量倍的体积分数为60％乙醇水溶液，回流提取3次，每次提取2小时，合并得到提取液，减压回收溶剂，浓缩后得到总浸膏；
(2)将总浸膏分散到10质量倍的水中，依次用等体积石油醚和乙酸乙酯进行萃取，乙酸乙酯萃取液减压回收溶剂，得到乙酸乙酯层浸膏；
(3)-(12)同实施例1(3)-(12)。
实施例4
睡茄交酯类化合物抑制小鼠巨噬细胞raw264.7释放一氧化氮(no)的活性测试小鼠巨噬细胞raw264.7(atcc)培养于10％热灭活(56℃，30min)胎牛血清(gibco，usa)、100u/ml青霉素钠(gibco，usa)、100μg/ml链霉素(gibco，usa)的rpmi1640(gibco，usa)培养液中，37℃，5％co2的恒温培养箱中孵育生长。由于no极不稳定，在细胞培养上清液内很快代谢成亚硝酸基(no2-)，故采用griess法测定样品中no2-的浓度作为衡量no水平的指标。griess试剂a：0.1％n-萘乙二胺盐酸盐(naphthylethylenediaminedihydrochloride)溶于水中；griess试剂b：1％对氨基苯磺酰胺(sulphanilamide)溶于5％h3po4中。使用前等体积混合试剂a和b。用rpmi1640培养液将raw264.7细胞稀释至5×105cells/ml浓度，接种于96孔细胞培养板中，每孔加入200100μl细胞悬浮液。co2培养箱中培养1h后，每孔加入脂多糖(lipopolysaccharide,lps)(sigma，jpn)(终浓度1μg/ml)和dmso溶解的不同浓度的测试样品0.4μl,同时设lps组(加入lps，但不加入测试样品，对no释放的抑制率为0％)和空白对照组(不加入lps和测试样品，仅加入0.4μldmso，对no释放的抑制率为100％)，每个样品设4个平行孔。在37℃，5％co2的恒温培养箱中培养24h，吸取100μl培养液上清至酶标板中，离心(1000×g，4℃，3min)，加入100μlgriess试剂，室温避光反应10min，于酶标仪测定其540nm处吸光值。用浓度分别为1、5、10、50μmol/l的nano2绘制标准曲线，根据nano2标准曲线细胞培养上清液中no2-的浓度进而计算测试样品对no释放的抑制率。
表3化合物的抑制no释放结果
含有本发明所述化合物的组合物的抗炎药物可以为适用于口服或注射等应用形式，例如，按常规技术，加入药物可接受的载体和/或赋形剂制成片剂、胶囊剂、粉剂、糖浆剂、针剂等。
化合物具有药理活性，因此，含有该化合物的组合物也具有药理活性。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其中心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护。
本发明的睡茄交酯类化合物、含睡茄交酯类化合物的提取物、含睡茄交酯类化合物的组合物能制备治疗一氧化氮代谢异常相关联疾病的药物。
其相关联的疾病包括：全身炎症反应综合症、高血压、脑血栓、心力衰竭、肝硬化、类风湿性关节炎、骨关节炎、脊柱关节炎、炎性肠病、急性胰腺炎、腹膜炎、胆囊炎、阑尾炎、糖尿病、系统性红斑狼疮、皮炎肌、银屑病、急性髓性白血病、帕金森症、早老性痴呆、抑郁症、败血症、慢性阻塞性肺炎、哮喘、急性胰腺炎、中枢神经损伤等。其次，no代谢异常还与癌变及癌组织的增生有关，高浓度的no也会诱发基因突变和肿瘤，上述化合物可以抑制no释放，从而发挥抗肿瘤的作用。适用的肿瘤例子包括但不限于：各种实体肿瘤和白血病，如肺癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、骨癌、食道癌、前列腺癌、结肠癌、卵巢癌、膀胱癌、子宫颈癌、黑色素瘤、睾丸癌、支气管癌、肾细胞癌、胆管癌、绒毛膜癌、胶质细胞瘤、神经纤维瘤、纤维肉瘤、淋巴管瘤等。