一种用于药物控释和基因载体的温度响应型聚合物的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于高分子材料和生物医学工程领域，具体涉及一种用于药物控释和基因载体的温度响应型聚合物的制备方法。
【背景技术】
[0002]癌症是一种严重威胁人类健康和生命的疾病，目前癌症的治疗方法可分为手术治疗和非手术治疗两大类，其中化疗是一种应用较广泛的非手术治疗方法。化疗是利用化学药物杀灭癌细胞的一种治疗方法，但由于化疗药物的选择性不强，在杀灭癌细胞的同时也会损伤人体正常细胞，因此需要研发高性能的载体材料用于控制药物释放，减轻对正常细胞的影响。
[0003]温度响应型聚合物能够根据外界温度变化发生相转变而改变自身结构，利用该特性可以达到药物控释的目的，是一种良好的药物载体材料。2-甲基-2-丙烯酸-2- (2-甲氧基乙氧基)乙酯(MEO2MA)和寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯(OEGMA)是两种新型的温度响应型材料，具有良好的生物相容性，近年来已成为一个新的研宄热点。Lutz等(Journal ofthe American Chemical Society 2006, 128，13046-47)研宄分析了 MEO2MA 和 OEGMA 的最低临界共溶温度(LCST)，指出可以通过改变两者的比例制备出具有不同LCST的温度响应型无规共聚物，在生物医药领域具有一定的潜在应用性。
[0004]基因治疗是一种新兴的癌症治疗技术，是指将人类正常基因或有治疗作用的基因导入癌细胞或组织，阻止癌细胞的生长、转移、复发，以达到治疗癌症的目的。基因载体是将目的基因导入靶细胞的工具，一直以来都是基因治疗的研宄重点之一，现如今常见的非病毒载体有脂质体、聚乙烯亚胺、壳聚糖等高分子材料。壳聚糖具有良好的生物相容性，且分子内含有许多氨基，在生理PH下会发生质子化而带正电荷，能够与基因上带负电荷的磷酸基团产生静电作用形成复合物，从而起到搭载外源基因的作用，但是壳聚糖存在分子量高、溶解性差、转染率低等缺点，限制了其在基因载体领域中的应用。低分子量壳聚糖，又称壳寡糖(Chitosan oligosaccharide, COS)是壳聚糖经过降解而得到的低聚合度寡糖产品，是自然界中唯一带正电荷的阳离子碱性氨基低聚糖。壳寡糖不仅保留了壳聚糖的基本性能，而且还具有水溶性好、抗肿瘤、抗菌等优良特性，是一种理想的基因载体材料。
[0005]利用疏水性单体开环聚合制备出大分子引发剂，结合原子转移自由基聚合，在大分子链上引入具有温度响应性的亲水链段MEO2MA和0EGMA，制备出两亲性嵌段共聚物，并结合点击化学反应，在两亲性嵌段共聚物上引入亲水性的壳寡糖分子链，制备出用于药物控释和基因载体的新型嵌段共聚物。这种两亲性嵌段共聚物在水溶液中能够自组装成具有温度响应性的胶束，该胶束可以作为化学药物和外源基因的载体材料，在生物医学、药物载体、基因治疗等领域将具有良好的发展前景。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种用于药物控释和基因载体的温度响应型聚合物的制备方法。
[0007]本发明的目的是依次将具有亲水性的温度响应型聚合物和带有氨基基团的亲水性壳寡糖引入到疏水性的生物可降解聚酯类大分子链段上，使获得的两亲性嵌段共聚物具有良好的生物相容性、生物降解性、温度响应性和阳离子特性，并能够在水溶液中组装成稳定的纳米胶束。本发明以2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯(MEO2MA)、寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯(OEGMA)、壳寡糖和环酯类单体为原料，采用开环聚合反应、原子转移自由基聚合反应和点击化学反应，制备一系列具有不同最低临界共溶温度(LCST)的温度响应型嵌段共聚物。
[0008]本发明提出的用于药物控释和基因载体的温度响应型聚合物的制备方法，具体步骤如下:
(1)将低分子量壳聚糖(壳寡糖COS)和邻苯二甲酸酐(PA)按照摩尔比为1:2?6(以壳寡糖中的吡喃糖环计算摩尔比)计量加入到N，N- 二甲基甲酰胺中，在氮气或氩气保护下反应，反应温度为100?150°C，反应时间为4?12小时，待反应产物冷却到室温，将其加入到甲醇中沉淀，抽滤，并用甲醇重复洗涤抽滤3次，将过滤产物在40°C下真空烘干24h，得到产物I邻苯二甲酰化壳寡糖；
(2)将步骤(I)得到的邻苯二甲酰化壳寡糖、4-戊炔酸、催化剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)和催化剂羟基苯并三唑(HOBt)按照摩尔比为1:4?8:4?8:2?4(以壳寡糖中的吡喃糖环计算摩尔比)计量加入到N，N-二甲基甲酰胺中，在氮气或氩气保护下室温反应24?72小时。反应结束后，将产物加入到甲醇中沉淀，抽滤，再用N，N-二甲基甲酰胺溶解后经甲醇沉淀，重复3次，将过滤产物在40°C下真空烘干24h，得到产物II炔基化邻苯二甲酰化壳寡糖；
(3)将步骤(2)得到的炔基化邻苯二甲酰化壳寡糖和水合肼(N2H4.Η20)按照摩尔比为1:5?10(以壳寡糖中的吡喃糖环计算摩尔比)计量加入到N，N-二甲基甲酰胺中，在氮气或氩气保护下反应，反应温度为80?140°C，反应时间为4?8小时，待反应产物冷却到室温，将其加入到甲醇中沉淀，抽滤，并用甲醇重复洗涤抽滤至滤液无色为止，将过滤产物在40°C下真空烘干24h，得到产物III炔基化壳寡糖，备用；
(4)将含有羟基官能团的引发剂A和环酯类单体B按照摩尔比为1:20?1000计量加入到反应Il中，按照单体总摩尔量的ο.οι?1%加入催化剂C，在氮气或氩气保护下反应，反应温度为100?140°C，反应时间为12?36小时，待反应产物冷却到室温，加入二氯甲烷使其溶解，将溶液加入到甲醇中沉淀，抽滤，再用二氯甲烷溶解后经甲醇沉淀，重复3次，将过滤产物在40°C下真空烘干24h，得到产物IV聚酯类高分子材料；
(5)将步骤(4)得到的聚酯类高分子材料和三乙胺(Et3N)按照摩尔比为1:4?50计量加入到二氯甲烷中，随后将反应体系冷却到0°C，并向其中逐滴滴加2-溴异丁酰溴溶液(用量为产物IV摩尔数的3?35倍，用二氯甲烷稀释5?10倍)，0°C搅拌2小时后移至室温下继续反应36-72小时。反应结束后旋蒸浓缩，并依次用饱和NaHCO3S液和去离子水反复洗涤多次，用无水硫酸镁除水后过滤、旋蒸浓缩，将溶液加入到甲醇中沉淀，抽滤，再用二氯甲烷溶解后经甲醇沉淀，重复3次，将过滤产物在40°C下真空烘干24h，得到产物V原子转移自由基聚合(ATRP)的大分子引发剂； (6)将步骤(5)得到的ATRP大分子引发剂、催化剂溴化亚铜、配体PMDETA、ME02MA单体和OEGMA单体按照摩尔比为1:2?20:2?20:10?1000:10?1000计量加入到四氢呋喃中，在氮气或氩气保护下反应，反应温度为40?80°C，反应时间为5?10小时，待反应产物冷却到室温，用四氢呋喃稀释后过中性氧化铝柱子以除去铜盐，旋蒸浓缩后透析除去未反应的单体，最后冷冻干燥得到产物VI温度响应型嵌段共聚物；
(7)将步骤(6)得到的温度响应型嵌段共聚物和叠氮化钠(NaN3)按照摩尔比为1:10?30计量加入到N，N- 二甲基甲酰胺中，在40?60°C温度下反应24?72小时。反应结束后旋蒸浓缩除去N，N- 二甲基甲酰胺，用四氢呋喃重新溶解产物后过中性氧化铝柱子以除去残留的钠盐，将溶液旋蒸浓缩后加入到正己烷中沉淀，抽滤，再用四氢呋喃溶解后经正己烷沉淀，重复3次，将过滤产物在40°C下真空烘干24h，得到产物VII叠氮化的温度响应型嵌