Y, Cold Spring Harbor)。所用引物及 DNA序列均由Invitrogen公司合成。
[0036] 本发明实施例所使用的质粒LVV的图谱如图1所示；所使用的质粒pLenti6/ V5-D-T0P0、pRRLSIN. cPPT. MSCV/GFP、293FT细胞为市售商品，所使用的试剂均为市售商品。
[0037] 本发明实施例提供了一种启动子优化的慢病毒表达体系，【具体实施方式】：
[0038] 实施例1 :慢病毒表达体系启动子的优化
[0039] 1)重组慢病毒的包装及滴度测定
[0040] 培养293FT细胞，转染前一天，以含10%胎牛血清的DMEM培养基调整细胞密度后， 按照每15cm细胞培养皿接种25 X 106个293FT细胞到细胞培养皿中，置于37°C，5 % C02培养 箱培养，16h~24h后待细胞密度生长到80%~90%时即可用于转染。转染当天更换培养基 为不含抗生素（P/S)的完全培养基（DMEM+10%FBS)。分别将LVV-MSCV-GFP，LVV-CMV-GFP， LVV-EF1 a-GFP，LVV-PGK-GFP，LVV-UBC-GFP慢病毒骨架与另外三种包装质粒一起共转染 293FT细胞，以Lipofectamine 2000 (Invitrogen)为媒介。培养6h后弃去培养基，用PBS 洗3次后更换为20ml新鲜的完全培养基换液（DMEM+10% FBS+P/S)。收集随后30-48h的 培养上清，6000rpm离心10min，弃去细胞碎片，上清液以0. 45 y m PVDF滤器过滤至50ml圆 底离心管中，4°C，50000g高速离心2h，小心弃去上清，DMEM(不含血清、双抗）重悬病毒沉 淀，按每次使用的病毒量分装到洁净的1.5mlEP管中，-80°C冰箱保存，用于感染T及NK细 胞。Lentivirus-Associated p24ELISA Kit 检测病毒的滴度为 5\107-1.5父108正1具体 步骤参见 Lentivirus-Associated p24ELISA Kit 的说明书。
[0041] 2) 5种启动子在PBMC中启动活性的比较
[0042] 从健康人外周血分离PBL，用⑶3/⑶28磁珠刺激T细胞生长3天，检测⑶8+/⑶4+ 比例，使⑶8+细胞达80%以上，将所制备的5种慢病毒及阴性对照与T细胞共培养3天，并 在IL-2(100IU/ml)的培养基中维持培养。重组慢病毒转导T细胞后利用流式细胞仪检测 GFP在T细胞的荧光强度。流式检测结果显示启动子的表达活性MSCV>PGK>UBC (图2)。
[0043] 实施例2 :采用分子生物学的技术方法将携带特异性识别人黑色素瘤相关抗原 gpl00(154-162)的鼠源TCRa和0链基因的重组慢病毒载体转染外周血自体淋巴细胞， 使重组TCR表达在T淋巴细胞中以达到高效杀伤肿瘤的目的。利用已优化启动子的慢病毒 载体构建含自我剪切2A肽、弗林蛋白酶（Furin)及间隔序列（序列见附表）的TCR表达载 体。
[0044] 1)优化构建表达TCR两条链的2A肽、弗林蛋白酶及间隔序列
[0045] 为了在同一表达载体中实现TCRa和0链基因的共表达，本发明采用在TCRa 和0链之间添加具有自剪切功能的2A肽，所采用的2A肽可以为F2A(foot-and-mouth disease virus)， E2A(equine Rhinitis A virus)， P2A(porcine teschovirus-1)， 丁2八(1110863 38181^￥；[；1018)等。由24肽连接表达1'0?€[和|3链基因已有报道，但是其氨 基酸残基对于TCR功能的影响还未得到充分的研宄。为了获得更多的接近天然TCR的两条 链，本发明在2A肽的前段设计了弗林蛋白酶识别位（R-A-K-R)。在慢病毒表达载体中，间隔 序列（GSG或SGSG等）可以促进Furin酶的剪切及2A肽在蛋白合成中的转换，最大化地实 现TCR两条链的合成。因此本发明最终开发了一种新型的双顺反子慢病毒载体，可以高效 表达两种蛋白组分，并充分结合了弗林蛋白酶切割位点，以及一个氨基酸间隔后2A转换肽 等（图3)。
[0046] 2) TCR a和0链基因在T淋巴细胞中的表达及抗肿瘤活性的研宄
[0047] 为了检测所优化的载体，本发明用抗gplOO的TCR载体转导从肿瘤瘤患者体内所 分离的PBL，并分析这些工程细胞的抗肿瘤活性。
[0048] a)肿瘤患者PBL的分离，按常规密度梯度离心方法实现。
[0049] b) T细胞培养及刺激活化，用⑶3/⑶28磁珠刺激T细胞生长3天，检测⑶8+/⑶4+ 比例，并在IL-2的培养基中维持培养。
[0050] C)重组慢病毒转导T细胞，用⑶3/⑶28磁珠刺激T细胞24小时后，把一定量的病 毒加到T细胞中，每个T细胞按3个慢病毒的转导比例，32度离心2小时，离心后的细胞放 回37度C02培养箱；3天后，利用流式细胞仪检测TCR在T细胞表面的表达。
[0051] d)体外检测基因修饰细胞对肿瘤细胞的杀伤实验：铬同位素标记肿瘤细胞，4小 时后，利用gamma技术器测定络同位素释放，同时测定细胞因子（IL-2和IFN-y)释放。
[0052] 3)TCRa和0链基因在⑶4、⑶8T淋巴细胞中的表达及抗肿瘤活性的研宄。
[0053] a)利用Myltenyi的磁珠技术从肿瘤患者的PBL中分离CD4及CD8T淋巴细胞。
[0054] b)MSCV启动子优化的慢病毒分别转导CD4及CD8T淋巴细胞，转导方法同上。利用 流式细胞仪检测TCR在⑶4及⑶8T淋巴细胞中的表达（图4)。
[0055] c)体外检测对肿瘤细胞的杀伤实验：铬同位素标记肿瘤细胞，把标记的肿瘤细胞 与TCR基因修饰的T细胞共培养，4小时后，利用ga_a技术器测定铬同位素释放，同时测定 细胞因子（IL-2和IFN- Y )的水平（图5)。
[0056] d)铬法检测重组慢病毒TCR感染的PBL对黑色素瘤细胞存活率的影响（图6)。
[0057] (1)将各组肿瘤细胞（624, 526, 888, 938)浓度调节至1 X 105,接种于96孔培养板， 100yL/^U
[0058] (2)效应细胞分组：a. PBMC对照组；b.经刺激PBMC对照组；c. TCR基因转染组。
[0059] (3)效靶比分组：效靶比分别为3:1 ;6:1 ;12:1 ;25:1 ;50:1。并设淋巴细胞对照组 (只加入淋巴细胞）、靶细胞对照组（只加入靶细胞）、最大裂解组各组设5复孔。
[0060] (4)效应细胞与靶细胞共培养，既37°C孵育4小时。
[0061] (5)弃去上清，加入适量10% SDS，利用细胞收集器收集细胞，应用同位素测定仪 检测同位素的活性。
[0062] (6)按照以下公式计算各组T细胞肿瘤杀伤活性：肿瘤细胞杀伤百分比=(实验 组-淋巴细胞对照组）八最大裂解组-靶细胞对照组）1100%。
[0063] 实施例3 :利用包装嵌合型抗原受体（chimeric antigen receptor, CAR)的MSCV 慢病毒载体，可以基因修饰T及NK细胞表达单链抗体，通过其对肿瘤细胞表面抗原的特异 性识别，并通过细胞内CD3zeta和41-BB双激活T及NK细胞，既能延长细胞存活时间，又能 增强其清除肿瘤的能力，在体内外对多种肿瘤进行有效杀伤。本发明通过anti-Her2/neu 单链抗体构建CAR载体，通过MSCV优化的慢病毒体系基因修饰人T及NK细胞，并使它们获 得特异性杀伤肿瘤的能力（图7、8、9)。在体外的细胞杀伤试验中，CAR工程化的淋巴细胞 可以明显地提高T细胞对HLA-A2+相对应的肿瘤细胞的识别，并释放T细胞活化的标志因 子 IFN- y 〇
[0064] 1)利用MSCV启动子构建新的慢病毒嵌合型抗原受体（CAR)载体
[0065] a)创建抗体的CAR载体及制备慢病毒，详细方法如上所述。
[0066] 2)研宄基因工程T细胞及其体外抑瘤作用
[0067] a)获取人T细胞：从健康人外周血分离PBMC，用可溶性抗-CD3抗体刺激T细胞， 第2天转导T细胞，方法同上。
[0068] b) CAR基因修饰T细胞：CAR慢病毒与T细胞培养3天，利用流式细胞仪检测TCR抗体在T细胞上的表达，并在IL-2的培养基中维持培养。
[0069] c) CAR基因修饰的T细胞对表达相对应抗原的肿瘤细胞的特异性识别。CEM、 MDA468为Her2/neu表达阴性肿瘤；MDA231、HBT-77为Her2/neu表达阳性肿瘤细胞。经基 因修饰的T细胞可以特异性识别表达Her2/neu的肿瘤细胞一MDA231及HBT-77,特异性释 放T细胞活化的标志因子IFN-y。
[0070] d)MSCV优化的慢病毒体系可以有效地基因修饰NK细胞，并较其它启动子具有高 效表达的特性。PBMC经NK细胞的扩增方法扩增2周后，NK细胞的比例可达95%以上。利 用上述方法制备的包涵GFP的MSCV慢病毒载体基因修饰NK细胞，3天后，利用流式细胞仪 检测CAR在NK细胞的表达水平，MSCV优化的启动子较其它的启动子具有高效表达的特性， 详见图10。
【主权项】
1. 一种启动子优化的慢病毒载体，其特征在于：采用MSCV启动子。
2. 根据权利要求书1所述的在重组慢病毒载体的多克隆位点顺序插入TCRa、furin、 间隔序列（SGSG)、2A肽、TCR0序列。
3. 根据权利要求书1所述在重组慢病毒载体的多克隆位点插入嵌合抗原受体序列。
4. 根据权利要求书1、2、3所述的重组慢病毒载体所述的启动子序列如SeqIDNO. 1， SeqIDNO. 2,SeqIDNO. 3 所示。
5. 根据权利要求书2所述的Furin、间隔序列、2A肽序列如SeqIDNO. 4，SeqIDNO. 5， SeqIDNO. 6 所示。
6. -种重组慢病毒，其特征在于权利1至5任一所述重组慢病毒载体与慢病毒辅助包 装质粒共转染宿主细胞得到的包装体。
7. 根据权利要求书6所述的重组慢病毒，所述宿主细胞为293FT。
8. 转染有权利要求6或7所述的重组慢病毒的基因修饰免疫细胞，包括NK细胞，T细 胞等。
9. 根据权利要求8所述的免疫细胞，来源于骨髓，外周血，组织等。
【专利摘要】本发明的启动子优化的慢病毒表达体系其特征在于采用了MSCV启动子，该启动子优化的慢病毒表达体系基因修饰T细胞使之表达抗肿瘤T细胞受体(TCR)，其特征在于：在多克隆位点顺序插入TCRα、furin间隔序列、2A肽、TCRβ序列；启动子优化的慢病毒载体构建的嵌合型抗原受体(CAR)表达载体其特征在于：在多克隆位点插入CAR序列。本发明重组慢病毒载体的应用，如使重组TCR表达在T细胞，及通过CAR表达在T或NK细胞以达到特异性杀伤肿瘤的目的，并可以应用到临床的肿瘤治疗中。
【IPC分类】A61P35-00, C12N15-867, C12N5-10
【公开号】CN104694575
【申请号】CN201510014645
【发明人】杨世成
【申请人】深圳市中美康士生物科技有限公司
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2015年1月12日