体生物模拟化合物，且所得复合物能够使多于一个Fe γ R交联。
[0119] 如上文讨论，在优选实施方案中，形成斯塔都聚体的斯塔都聚体单体间连接是由 斯塔都聚体单体的自组装产生的连接。在一个实施方案中，构成斯塔都聚体的两个斯塔 都聚体单体是相同的肽，从而构成斯塔都聚体的两个独立斯塔都聚体单体在序列上是相同 的。然而，熟练技术人员将理解其它实施方案包括其中氨基酸序列上彼此不同的斯塔都聚 体单体的斯塔都聚体。
[0120] 两个斯塔都聚体单体可以例如通过平行对齐形成斯塔都聚体，从而在斯塔都聚体 单体中的相同的Fe局部结构域单体之间发生配对。然而，本发明也包括其中配对在不相同 的Fe局部结构域单体之间发生的实施方案和其中配对在斯塔都聚体单体的相同的Fe局部 结构域单体之间发生，但是这两个斯塔都聚体单体的比对偏移的实施方案。
[0121] 多聚化结构域
[0122] 多聚化结构域可以包含引起二聚体蛋白质进一步多聚化的肽序列。如本文中所 使用的"多聚化"是指多个（即，两个或更多个）独立斯塔都体同源二聚体连接或结合在一 起。例如，当至少一个斯塔都体同源二聚体（即，至少一个包含一个或多个Fc结构域和一 个或多个Fab结构域的同源二聚多肽）经由多聚化结构域连接于至少一个其它斯塔都体同 源二聚体时，斯塔都体发生多聚化。肽多聚化结构域的实例包括IgG2铰链、异亮氨酸拉链、 胶原蛋白甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸重复序列（"GPP"）和锌指结构。在本领域中充分描述 了糖基化对肽多聚化的影响（例如，Role of Carbohydrate in Multimeric Structure of Factor VIII/V on Willebrand Factor Protein. Harvey R. Gralnick, Sybil B. Williams 和Margaret E. Rick. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,第80卷，第9期，[Part l:Biological Sciences] (1983年5月 I 日）， 第2771-2774页；Multimerization and collagen binding of vitronectin is modulated by its glycosylation. Kimie Asanuma, Fumio Arisaka和 Haruko Ogawa. International Congress Series 第 1223 卷，2001 年 12 月，第 97-101 页）。
[0123] 在一个优选实施方案中，多聚化结构域是IgG2铰链。如本领域中已知，人IgG2 的铰链区可以形成共价二聚体（Υ〇〇，Ε·Μ·等，J. Immunol. 170, 3134-3138 (2003) ;Salfeld Nature Biotech. 25, 1369-1372 (2007))。IgG2的二聚体形成可能借助IgG2铰链结构通过 C-C键介导（Yoo等，2003)，表明单独的铰链结构可以介导二聚体形成。然而，人血清中存 在的IgG2二聚体的量是有限的。不存在IgG2的多聚化超越同源二聚体的二聚体的定量证 据。（Yoo等，2003)。即，没有发现天然IgG2在人血清中形成更高阶多聚体。
[0124] 人 IgG2 铰链单体的氨基酸序列如下：ERKCCVECPPCP(SEQ ID N0:3)。SEQ ID N0:3 中的4个半胱氨酸的任一个的突变都可能与大幅度削弱斯塔都体的多聚化相关。存在IgG2 铰链单体的两个C-X-X-C部分。因此，本发明的斯塔都体可以包含IgG2铰链单体的完整 12个氨基酸序列，或任意一个或两个的四氨基酸核心，连同Fc结构域单体。尽管核心结构 的X-X可以是任何氨基酸，但在优选实施方案中，X-X序列是V-E或P-P。熟练技术人员将 理解，IgG2铰链区单体可以由除核心的四个氨基酸结构之外的铰链区序列的任意部分组 成，所述部分包括IgG2铰链区序列的全部和IgG2CH2和CH3结构域单体序列的一些或全 部。不受理论约束，一个斯塔都体同源二聚体的IgG2铰链多聚化结构域可以通过与另一 个斯塔都体同源二聚体的任何部分相互作用而形成多聚体。即，一个斯塔都体同源二聚体 的IgG2铰链可以通过结合另一个斯塔都体同源二聚体的IgG2铰链进行多聚化，从而形成 同源二聚体的二聚体或更高阶多聚体，同时相对于天然IgGIFc，保留增加的与Fc受体的功 能性结合。可选地，一个斯塔都体同源二聚体的IgG2铰链结构域可以结合另一个斯塔都 体同源二聚体的IgGl铰链，从而形成同源二聚体的二聚体或更高阶多聚体，同时相对于天 然IgGIFc，保留增加的与Fc受体的功能性结合。还可能的是，一个斯塔都体同源二聚体的 IgG2铰链结构域与IgGlFc结构域的另一个部分（即，另一个斯塔都体同源二聚体的CH2 结构域或CH3结构域）结合以形成同源二聚体的二聚体或更高阶多聚体，同时相对于天然 IgGIFc，保留增加的与Fc受体的功能性结合。
[0125] 在另一个优选实施方案中，亮氨酸拉链可以用作多聚化结构域。在另一个优选 实施方案中，异亮氨酸拉链可以用作多聚化结构域。已知亮氨酸拉链和异亮氨酸拉链 (卷曲螺旋结构域）促进蛋白质二聚体、三聚体和四聚体的形成（Harbury等，Science 262:1401-1407(1993) ;0, Shea 等，Science 243:538(1989))。
[0126] 尽管熟练技术人员将理解，可以使用不同类型的亮氨酸拉链和异亮氨酸拉 链，但在一个实施方案中，使用来自如所描述那样经修饰的GCM转录调节物的异 亮氨酸拉链（Morris 等，Mol. Immunol. 44:3112-3121(2007) ;Harbury 等，Science 262:1401-1407(1993)) ：GGGSIKQIEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGERGHGGG(SEQ ID N0:5)。 在另一个实施方案中，所使用的异亮氨酸拉链的序列是：GGGSIKQIEDKIEEILSKIYHIENEIARI KKLIGERGHDI (SEQ ID NO: 32)。这些异亮氨酸拉链序列仅是可以用于Fe结构域单体多聚化 的若干种可能序列中的两种。尽管可以使用SEQ ID N0:5或32中所示出的整个序列，但是 序列中加下划线的部分代表了可用于本发明的斯塔都体中的异亮氨酸拉链的核心序列。因 此，构成本发明的斯塔都体的斯塔都聚体单体可以包含异亮氨酸拉链的完整氨基酸序列， 或28个氨基酸核心，连同一个或多个Fc结构域单体。熟练技术人员还将理解，除核心28 个氨基酸结构之外，异亮氨酸拉链可以由拉链的任何部分组成，并且因此可以由多于28个 氨基酸但是小于SEQ ID NO:5或32的整个序列的氨基酸组成。
[0127] 在另一个优选实施方案中，GPP重复序列可以用作多聚化结构域。GPP是存在于人 胶原蛋白中的引起胶原蛋白：蛋白质结合的氨基酸序列。尽管熟练技术人员将理解，不同 类型的GPP重复序列可以用作多聚化结构域，但在优选实施方案中，使用如所描述那样的 甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸重复序列（Fan等，FASEB Journal 3796第22卷2008) : (SEQ ID NO: 26)。这种甘氨酸-脯氨酸-脯氨酸重复序列仅是可用于使斯塔都体多聚化的若干种可 能序列之一。尽管可以使用SEQ ID N0:26中所示出的整个序列，但是不同长度的重复序列 也有可能可用来使Fc结构域单体多聚化。同样，还可以对GPP重复序列内的含有不同氨基 酸的重复序列进行置换。
[0128] 斯塔都体
[0129] 本发明涉及斯塔都体及制备和使用斯塔都体的方法。如本文中所使用，"斯塔都 体"是指包含两个或更多个与一个或多个Fab结构域连接的Fc结构域的分子。因此，借助 于这样的Fab结构域和Fc结构域，斯塔都体具有抗原结合能力和Fc γ受体结合活性。在 一些实施方案中，Fcy受体活性可能是由于能够结合并交联等于或大于天然结构全抗体的 Fc部分的Fc γ R。所述斯塔都体的Fab部分可包含重链和轻链。可变重链和轻链可以独立 地来自于任何相容的免疫球蛋白，诸如IgAl、IgA2、IgM、IgD、IgE、IgGl、IgG2、IgG3或IgG4， 并且可以来自于相同或不同的Ig同种型，但优选来自于相同的Ig同种型。轻链κ或λ 也可以来自于不同的Ig同种型。在一些实施方案中，斯塔都体，如斯塔都聚体，可以结合两 个或更多个Fc γ R且调节免疫功能。在一个实施方案中，本发明的斯塔都体包含Fab结构 域、一个或多个Fc结构域和一个或多个多聚化结构域，其中所述一个或多个多聚化结构域 中的至少一个分隔两个或更多个Fc结构域，或位于Fc区的羧基端。术语"Fc区"在本文中 用于指包含Fc结构域、结构域连接和多聚化结构域的斯塔都体区域。因此，Fc区是不包含 Fab结构域的斯塔都体区域。上文描述了多聚化结构域，并且其为已知会在其天然存在的蛋 白质中引起蛋白质多聚化的氨基酸序列。在一个实施方案中，多聚化结构域可以是IgG铰 链、异亮氨酸拉链或其组合。在具体实施方案中，斯塔都体由Fab、第一 Fc结构域、异亮氨酸 拉链、IgG2铰链和第二Fc结构域构成。Fab包含在天然免疫球蛋白结构中存在的重链和轻 链。
[0130] 本发明的斯塔都体可分类为连续斯塔都体或C末端斯塔都体。这些斯塔都体的一 般结构示于图1中。本发明的连续斯塔都体和C末端斯塔都体优选包含Fab结构域；一个 或多个Fc结构域；和一个或多个多聚化结构域。例如，本发明的连续斯塔都体和C末端斯 塔都体优选包含Fab结构域；1个、2个、3个、4个或5个Fc结构域；和1个、2个、3个、4个 或5个多聚化结构域。在一些实施方案中，本发明的连续斯塔都体和C末端斯塔都体还包 含一个或多个间隔区或柔性连接子。连续斯塔都体优选包含2个或更多个Fc结构域。例 如，连续斯塔都体优选包含2个、3个、4个、5个或6个Fc结构域。
[0131] 连续斯塔都体被设计成通过在嵌合重链中并入两个或更多个Fc结构域而同时结 合并交联多个低亲和力FcyR。Fc结构域由一个或多个不同的或相同的多聚化结构域、间 隔区和/或柔性连接子分隔。连续斯塔都体可以是多聚化连续斯塔都体或非多聚化连续斯 塔都体。多聚化连续斯塔都体包含至少一个与多聚体的形成相关的多聚化结构域。上文 描述了多聚化结构域且其包括IgG2铰链、异亮氨酸拉链、胶原蛋白GPP和锌指结构。非多 聚化连续斯塔都体可以不包含多聚化结构域，但可以包含一个或多个结构域连接，诸如G4S 连接子。在一些实施方案中，多聚化连续斯塔都体包含一个或多个多聚化结构域和一个或 多个结构域连接。连续斯塔都体的一般结构示于图2中。包含一个或多个所指示的多聚化 结构域和/或连接子结构域的示例性连续斯塔都体构建体的更具体结构（ILZ是指异亮氨 酸拉链；2H是指IgG2铰链；且G 4S是指氨基酸序列Gly4Ser)示于图3中。包含对EGFR具 有特异性的Fab区的连续斯塔都体构建体示于下表1中。包含对HER2/neu具有特异性的 Fab区或对CD20具有特异性的Fab区的连续斯塔都体构建体示于图4和下表1中。
[0132] C末端多聚化斯塔都体被设计成通过在Fc区的C末端并入一个或多个多聚化结 构域而同时结合并交联多个低亲和力Fc γ R且借此促进形成能够同时与多个Fc受体相互 作用的斯塔都体复合体。C末端斯塔都体的示例性结构示于图5中。包含抗EGFR Fab的C 末端多聚化斯塔都体示于图6和下表1中。包含抗CD20Fab的C末端多聚化斯塔都体构建 体也示于图6和下表1中。在C末端斯塔都体中，重链的Fc区在C末端侧具有一个或多个 不同的或相同的多聚化结构域、间隔区或柔性连接子。所示出的C末端斯塔都体还包括含 有多聚化结构域和纯化标签的构建体。
[0133] 表1.未改变的单克隆抗体和斯塔都体构建体
[0134]
【主权项】
1. 一种斯塔都体，其包含Fab结构域；一个或多个Fc结构域；和一个或多个多聚化结 构域，其中所述一个或多个多聚化结构域能够使所述斯塔都体多聚化。
2. 如权利要求1所述的斯塔都体，其包含两个Fc结构域且其中所述一个或多个多聚化 结构域分隔所述两个Fc结构域。
3. 如权利要求1所述的斯塔都体，其中所述一个或多个多聚化结构域中的至少一个位 于所述Fc区的羧基端。
4. 如权利要求1所述的斯塔都体，其中所述一个或多个多聚化结构域独立地选自异亮 氨酸拉链、IgG2铰链和GPP重复序列。
5. 如权利要求1所述的斯塔都体，其中所述斯塔都体包含至少一个IgG2铰链结构域， 其中所述IgG2铰链结构域的氨基酸序列与SEQIDNO: 3具有至少80%同源性，且其中所述 IgG2铰链能够使所述斯塔都体多聚化。
6. 如权利要求1所述的斯塔都体，其中所述斯塔都体包含至少一个异亮氨酸拉链，其 中所述至少一个异亮氨酸拉链的氨基酸序列与SEQIDN0:32具有至少80%同源性，且其中 所述异亮氨酸拉链能够使所述斯塔都体多聚化。
7. 如权利要求1所述的斯塔都体，其中所述斯塔都体包含两个多聚化结构域。
8. 如权利要求7所述的斯塔都体，其中所述两个多聚化结构域是异亮氨酸拉链和IgG2 铰链。
9. 如权利要求8所述的斯塔都体，其中所述两个多聚化结构域分隔两个Fc结构域。
10. 如权利要求8所述的斯塔都体，其中所述两个多聚化结构域中位于所述Fc区的羧 基端。
11. 如权利要求1所述的斯塔都体，其中所述斯塔都体包含三个多聚化结构域。
12. 如权利要求1所述的斯塔都体，其中所述斯塔都体包含四个多聚化结构域。
13. 如权利要求1所述的斯塔都体，其中所述至少一个Fc结构域是IgGlFc结构域。
14. 如权利要求13所述的斯塔都体，其中所述IgGlFc结构域包含IgGl铰链、IgGl CH2 和IgGlCH3。
15. 如权利要求1所述的斯塔都体，其中所述一个或多个Fc结构域中的至少一个包含 IgG2铰链。
16. 如权利要求15所述的斯塔都体，其中所述Fc结构域包含IgG2铰链、IgGlCH2和 IgGlCH3〇
17. 如权利要求13所述的斯塔都体，其中至少一个IgGlFc结构域的所述氨基酸序列 与SEQIDNO: 2具有至少80%同源性。
18. 如权利要求2所述的斯塔都体，其中所述斯塔都体从氨基到羧基末端包含： (a) Fab结构域； (b) 第一Fc结构域； (c) 异亮氨酸拉链； (d) IgG2铰链；和 (e) 第二Fc结构域。
19. 如权利要求2所述的斯塔都体，其中所述斯塔都体从氨基到羧基末端包含： (a)Fab结构域； (b) 第一Fc结构域； (c) IgG2 铰链； (d) 异亮氨酸拉链；和 (e) 第二Fc结构域。
20. 如权利要求2所述的斯塔都体，其中所述斯塔都体从氨基到羧基末端包含： (a) Fab结构域； (b) 第一Fc结构域； (c) 异亮氨酸拉链；和 (e)第二Fc结构域。
21. 如权利要求2所述的斯塔都体，其中所述斯塔都体从氨基到羧基末端包含： (a) Fab结构域； (b) 第一Fc结构域； (c) IgG2铰链；和 (e)第二Fc结构域。
22. 如权利要求2所述的斯塔都体，其中所述斯塔都体从氨基到羧基末端包含： (a) Fab结构域； (b) 第一Fc结构域； (c)G4S结构域； (d) IgG2铰链；和 (e) 第二Fc结构域。
23. 如权利要求2所述的斯塔都体，其中所述斯塔都体从氨基到羧基末端包含： (a) Fab结构域； (b) 第一Fc结构域； (c) IgG2 铰链； (d)G4S结构域；和 (e) 第二Fc结构域。
24. 如权利要求2所述的斯塔都体，其中所述斯塔都体从氨基到羧基末端包含： (a) Fab结构域； (b) 第一Fc结构域； (c)G4S结构域； (d) 异亮氨酸拉链；和 (e) 第二Fc结构域。
25. 如权利要求2所述的斯塔都体，其中所述斯塔都体从氨基到羧基末端包含： (a) Fab结构域； (b) 第一Fc结构域； (c) 异亮氨酸拉链； (d)G4S结构域；和 (e) 第二Fc结构域。
26. 如权利要求2所述的斯塔都体，其中所述斯塔都体从氨基到羧基末端包含： (a) Fab结构域； (b) 第一Fc结构域； (c) GPP结构域；和 (d) 第二Fc结构域。
27. 如权利要求2所述的斯塔都体，其中所述斯塔都体从氨基到羧基末端包含： (a) Fab结构域； (b) 第一Fc结构域； (c)GPP结构域； (d) IgG2铰链；和 (e) 第二Fc结构域。
28. 如权利要求2所述的斯塔都体，其中所述斯塔都体从氨基到羧基末端包含： (a) Fab结构域； (b) 第一Fc结构域； (c) IgG2 铰链； (d)GPP结构域；和 (e) 第二Fc结构域。
29. 如权利要求2所述的斯塔都体，其中所述斯塔都体从氨基到羧基末端包含： (a) Fab结构域； (b) 第一Fc结构域； (c)GPP结构域； (d) 异亮氨酸拉链；和 (e) 第二Fc结构域。
30. 如权利要求2所述的斯塔都体，其中所述斯塔都体从氨基到羧基末端包含： (a) Fab结构域； (b) 第一Fc结构域； (c) 异亮氨酸拉链； (d)GPP结构域；和 (e) 第二Fc结构域。
31. 如权利要求18至30中任一项所述的斯塔都体，其中所述第一Fc结构域和所述第 二Fc结构域是IgGlFc结构域。
32. 如权利要求18所述的斯塔都体，其中所述斯塔都体的氨基酸序列与SEQIDNO: 33 具有至少80%同源性。
33. 如权利要求18所述的斯塔都体，其中所述斯塔都体的氨基酸序列与SEQIDNO: 35 具有至少80%同源性。
34. 如权利要求18所述的斯塔都体，其中所述斯塔都体的氨基酸序列与SEQIDNO: 37 具有至少80%同源性。
35. 如权利要求3所述的斯塔都体，其中所述斯塔都体从氨基到羧基末端包含： (a) Fab结构域； (b)Fc结构域； (C)异亮氨酸拉链；和 (d)IgG2 铰链。
36. 如权利要求3所述的斯塔都体，其中所述斯塔都体从氨基到羧基末端包含： (a) Fab结构域； (b)Fc结构域； (c) IgG2铰链；和 (d) 异亮氨酸拉链。
37. 如权