具有抗原结合和多价FCγ受体结合活性的分子的制作方法
【专利说明】具有抗原结合和多价FC γ受体结合活性的分子
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2012年8月20日提交的美国临时申请号61/691，057和于2013年 3月14日提交的美国临时申请号61/785, 144的优先权，所述申请的内容通过引用整体并入 本文。
[0003] 以电子方式提交的文本文件的描述
[0004] 随本文以电子方式提交的文本文件的内容通过引用整体并入本文：序列表的计算 机可读格式副本（文件名：GLIK_009_01US_310975_2048_SeqList_ST25. txt，记录日期： 2013年3月12日，文件大小329千字节）。 发明领域
[0005] 本发明总体上涉及免疫学、自身免疫、炎症、传染病和肿瘤免疫学领域。更具体地 说，本发明涉及包含免疫球蛋白Fc结构域和Fab结构域的生物学活性生物模拟分子、包含 这类生物模拟物的组合物和制备及使用这类生物模拟物的方法。
[0006] 发明背景
[0007] 单克隆抗体（mAb)疗法是医学中的一个重要且不断增长的部分。无论在美国或是 欧洲，已批准超过30种单克隆抗体用于各种免疫疾病、传染病和癌症，且数百种正在研宄 中。然而，在单克隆抗体疗法开发中的一个常见问题是尽管存在Fab和FcR结合但缺乏足 够效力。因为通常有必要用高剂量以便实现疗效，所以不利副作用往往与治疗性抗体相关 联。此外，肿瘤和其它靶抗原的低表达或改变的表达，以及影响抗体靶标或抗体结合的下游 效应的基因突变可致使抗体疗法无效。作为一个实例，单克隆抗体曲妥珠单抗是特异性对 抗HER2/neu乳腺癌抗原的mAb，并且能以商品名Herceptin?'商购获得，其已被美国食品和 药物管理局批准用于治疗乳腺癌。曲妥珠单抗可能在高度表达HER2/neu的患者中有效；然 而，大约90%的乳腺癌患者患有未被归类为高度表达HER2/neu的肿瘤。作为另一个实例， 西妥昔单抗（特异性对抗表皮生长因子受体（EGFR)的mAb，并且能以商品名Erbitux?商 购获得）已被美国食品和药物管理局批准用于治疗结肠癌。西妥昔单抗阻断EGFR且阻止 下游KRAS蛋白依赖性肿瘤增生途径。从临床角度看，西妥昔单抗可以改良具有野生型（WT) KRAS肿瘤的患者的整体反应率以及无疾病进展存活期。不幸的是，30% -60%的结肠癌患 者的肿瘤具有密码子12或13KRAS突变，且最近的临床试验表明，具有突变KRAS的患者未 受益于西妥昔单抗的治疗（汇总于Allegra等，Journal of Clinical Oncology，2009年 4月20日；27(12) :2091-6)。因此，需要用于治疗癌症以及用于治疗自身免疫性病症和炎 性疾病的新的基于类抗体的治疗剂。
[0008] 由抗体所致的免疫细胞且尤其是自然杀伤（NK)细胞上的Fc受体，特别是低亲和 力受体，诸如Fc γ RIIIa的接合和聚集导致标靶肿瘤或细胞在被称为抗体依赖性细胞毒性 (ADCC)的过程中活化、脱粒和溶解。也可以通过以下方式杀伤肿瘤细胞和免疫系统所靶向 的其它细胞：通过补体依赖性细胞毒性（CDC)，其中抗体结合补体，从而导致细胞毒性；或 通过抗体与抗原在不存在NK细胞或补体的情况下直接结合所致的直接细胞毒性（DC);或 通过其它机制，诸如诱导细胞凋亡，或干扰细胞生长或过程。目前，现有技术中需要鉴别增 加 ADCC、CDC、DC和杀伤肿瘤细胞或其它细胞的其它机制的手段，由此增加 mAb疗法的效力。 具体地说，当用于细胞杀伤的补体依赖性途径是全功能途径时，CDC可以是一种用于杀伤癌 细胞和其它靶细胞的有效方法。然而，由于细胞膜修复机制和诸如抑制补体途径的CD59等 调节蛋白，许多细胞具有CDC抗性。例如，尽管B细胞淋巴瘤和白血病细胞上的CD20表达 水平较高，但至少部分是由于补体抑制机制，患有B细胞恶性肿瘤的许多患者对用抗CD20 单克隆抗体利妥昔单抗治疗无反应或具有抗性（Harjunpaa等，Scand. J. Immunol, 200051 ; 634-641)。因此，特别需要能够增加⑶C的分子。
[0009] 发明概述
[0010] 本发明涉及包含免疫球蛋白Fc结构域、Fab结构域和多聚化结构域的生物学活性 生物模拟分子；包含这类生物模拟物的组合物；和制备及使用这类生物模拟物的方法。这 些生物模拟物广泛应用于治疗癌症、炎性、自身免疫性和传染病病状，其中单克隆抗体可用 于或已用于临床应用中。与其Fab跟本发明的生物模拟物中所包含的Fab相同的mAb相比， 本发明的生物模拟物的优点是具有更有效的抗体介导的细胞毒性、补体介导的细胞毒性和 补体clq结合。与其Fab对相同抗原具有特异性的mAb相比，本发明的生物模拟物还具有 更有效的补体依赖性细胞毒性和直接细胞毒性的优点。
[0011] WO 2008/151088公开了优选在斯塔都聚体（Stradomer)的情况下使用包含与一 个或多个Fab结构域连接的两个或更多个Fc结构域的生物模拟分子来治疗病理学病状，包 括癌症、自身免疫疾病及其它炎性病状和传染病。W02008/151088通过引用整体并入本文。 WO 2008/151088中所公开的包含Fab的分子被称为"斯塔都体（stradobody) "，且拥有单克 隆抗体的Fab部分的抗原结合性质和斯塔都聚体的Fc受体结合性质。因此，这些斯塔都体 同时结合、交联并活化效应细胞上的多个Fcy受体，从而产生无法通过各个mAb或免疫球 蛋白Fc骨架与各个Fc γ受体结合而实现的亲合力，即使经由Fc诱变、脱岩藻糖基化或能 提高各个mAb与各个Fcy受体之间的亲和力的其它方法加以优化。效应细胞上的Fcy受 体的多价结合在低表位表达的环境中特别重要。低表位表达导致mAb Fab结合事件过于孤 立而不能在效应细胞上足够邻近处产生足够密度的Fc-Fcy受体结合事件以引起效应细 胞上的低亲和力Fcy受体的下游活化。然而，如本文所公开，除Fab和Fc结构域之外，包 括一个或多个多聚化结构域增强斯塔都体的Fc γ R结合活性，从而导致亲合力的缓慢解离 特征以及抗体依赖性细胞毒性（ADCC)、补体介导的细胞毒性（CDC)、直接细胞毒性（DC)、强 补体clq结合和/或细胞毒性的其它机制。具体地说，多聚化结构域位于两个Fc结构域之 间或本文所公开的斯塔都体中的Fc区的羧基端处。令人惊讶的是，包含两个特定多聚化结 构域、异亮氨酸拉链和IgG2铰链的斯塔都体产生特别强的多聚化、对抗靶细胞的高细胞毒 性和高的clq结合。
[0012] Nagashima 等(Journal of Bioscience and Bioengineering 111(4):391-6(2011)和 Molecular Immunology 45(10):2752-63(2008))描述了如 W02008/151088所预期的具有Fe结构域的串联重复序列的连续斯塔都体，其产生的ADCC相 对于源自它们的亲本单克隆抗体（即，包含相同的Fab区）有所增强。然而，由于多聚化结 构域，本发明的斯塔都体导致斯塔都体同源二聚体多聚化，当与诸如Nagashima和别处所 描述的那些非多聚复合物相比时，这继而增加能够同时结合Fc γ R的Fc结构域的数目且最 终产生非常优良的结合和细胞毒性。
[0013] 在一个方面，本发明涉及一种斯塔都体，其包含Fab结构域、一个或多个Fc结构域 和一个或多个多聚化结构域。在另一实施方案中，所述一个或多个多聚化结构域能够使所 述斯塔都体多聚化。在一个实施方案中，所述一个或多个多聚化结构域中的至少一个分隔 两个或更多个Fc结构域。在另一个实施方案中，所述一个或多个多聚化结构域中的至少一 个位于所述Fc区的羧基端。在一个优选实施方案中，一个或多个Fc结构域是IgGlFc结构 域。
[0014] 在一个实施方案中，本发明涉及一种斯塔都体，其包含Fab结构域、一个或多个Fc 结构域和一个或多个多聚化结构域，其中所述一个或多个多聚化结构域能够使所述斯塔都 体多聚化。在另一个实施方案中，所述多聚化结构域独立地选自异亮氨酸拉链、IgG2铰链和 GPP重复序列。在另一个实施方案中，所述斯塔都体包含两个多聚化结构域。在另一实施方 案中，所述两个多聚化结构域独立地选自异亮氨酸拉链、IgG2铰链和GPP重复序列。在另 一实施方案中，所述两个多聚化结构域是异亮氨酸拉链和IgG2铰链。在另一实施方案中， 所述两个多聚化结构域都是IgG2铰链。在另一个实施方案中，所述两个多聚化结构域都是 异亮氨酸拉链。在另一个实施方案中，所述斯塔都体包含三个多聚化结构域。在另一个实 施方案中，所述斯塔都体包含四个或更多个多聚化结构域。
[0015] 在一个实施方案中，本发明涉及一种斯塔都体，其包含Fab结构域、一个或多个Fc 结构域和一个或多个多聚化结构域，其中所述一个或多个多聚化结构域能够使所述斯塔都 体多聚化，且其中所述一个或多个多聚化结构域中的至少一个是异亮氨酸拉链。在另一实 施方案中，所述至少一个异亮氨酸拉链是根据SEQ ID NO:32,且能够使所述斯塔都体多聚 化。在另一个实施方案中，所述一个或多个多聚化结构域中的至少一个是IgG2铰链结构 域。在另一实施方案中，所述至少一个IgG2铰链结构域是根据SEQ ID NO: 3,且能够使所 述斯塔都体多聚化。在另一个实施方案中，所述一个或多个多聚化结构域中的至少一个是 GPP结构域。在另一实施方案中，所述至少一个GPP结构域包含根据SEQ ID NO: 26的氨基 酸序列，且能够使所述斯塔都体多聚化。
[0016] 在一个实施方案中，本发明涉及一种斯塔都体，其包含Fab结构域、一个或多个Fc 结构域和一个或多个多聚化结构域，其中所述一个或多个多聚化结构域能够使所述斯塔都 体多聚化。在另一实施方案中，至少一个Fc结构域是IgGl Fc结构域，且所述至少一个Fc 结构域包含IgGl CH2和IgGl CH3。在另一实施方案中，所述Fc结构域包含IgGl铰链、IgGl CH2和IgGl CH3。在另一个实施方案中，所述斯塔都体包含多于一个Fc结构域。在另一实 施方案中，所述多于一个Fc结构域各自为IgGl Fc结构域。在另一实施方案中，所述多于 一个Fc结构域各自为IgG3 Fc结构域。在另一实施方案中，所述多于一个Fc结构域各自 为IgG2 Fc结构域。在另一实施方案中，所述多于一个Fc结构域各自为IgG4 Fc结构域。 在另一实施方案中，所述多于一个Fc结构域由IgGl Fc结构域和IgG2 Fc结构域、IgG3 Fc 结构域或IgG4 Fe结构域构成。
[0017] 在一个实施方案中，本发明涉及一种斯塔都体，其中所述斯塔都体从氨基到羧基 末端包含Fab结构域、第一 Fe结构域、第一多聚化结构域、第二多聚化结构域和第二Fe结 构域。在另一实施方案中，所述Fe结构域中至少一个是IgGlFc结构域。在另一个实施方案 中，所述斯塔都体从氨基到羧基末端包含Fab结构域、第一 Fe结构域、IgG2铰链、异亮氨酸 拉链和第二Fe结构域。在另一个实施方案中，所述斯塔都体从氨基到羧基末端包含Fab结 构域、第一 Fe结构域、异亮氨酸拉链、IgG2铰链和第二Fe结构域。在一个特别优选的实施 方案中，所述第一 Fe结构域、异亮氨酸拉链、IgG2铰链和第二Fe结构域共同包含根据SEQ ID N0:69的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述斯塔都体从氨基到羧基末端包含Fab 结构域、第一 Fe结构域、IgG2铰链、第二IgG2铰链和第二Fc。在另一个实施方案中，所述 斯塔都体从氨基到羧基末端包含Fab结构域、第一 Fe结构域、异亮氨酸拉链、第二异亮氨酸 拉链和第二Fe结构域。在另一个实施方案中，所述斯塔都体从氨基到羧基末端包含Fab结 构域、第一 Fe结构域、异亮氨酸拉链和第二Fe结构域。在另一个实施方案中，所述斯塔都 体从氨基到羧基末端包含Fab结构域、第一 Fe结构域、IgG2铰链和第二Fe结构域。在另 一个实施方案中，所述斯塔都体从氨基到羧基末端包含Fab结构域、第一 Fe结构域、G4S结 构域、IgG2铰链和第二Fe结构域。在另一个实施方案中，所述斯塔都体从氨基到羧基末端 包含Fab结构域、第一 Fe结构域、IgG2铰链、G4S结构域和第二Fe结构域。在另一个实施 方案中，所述斯塔都体从氨基到羧基末端包含Fab结构域、第一 Fe结构域、G4S结构域、异 亮氨酸拉链、第二Fe结构域。在另一个实施方案中，所述斯塔都体从氨基到羧基末端包含 Fab结构域、第一 Fe结构域、异亮氨酸拉链、G4S结构域和第二Fe结构域。在另一个实施方 案中，所述斯塔都体从氨基到羧基末端包含Fab结构域、第一 Fe结构域、GPP结构域和第二 Fe结构域。在另一个实施方案中，所述斯塔都体从氨基到羧基末端包含Fab结构域、第一 Fe结构域、GPP结构域、IgG2铰链和第二Fe结构域。在另一个实施方案中，所述斯塔都体 从氨基到羧基末端包含Fab结构域、第一 Fe结构域、IgG2铰链、GPP结构域和第二Fe结构 域。在另一个实施方案中，所述斯塔都体从氨基到羧基末端包含Fab结构域、第一 Fe结构 域、GPP结构域、异亮氨酸拉链和第二Fe结构域。在另一个实施方案中，所述斯塔都体从氨 基到羧基末端包含Fab结构域、第一 Fe结构域、异亮氨酸拉链、GPP结构域和第二Fe结构 域。熟练技术人员将认识到可以使用其它多聚化结构域代替此处描述的多聚化结构域。
[0018] 在另一实施方案中，所述第一 Fe结构域和所述第二Fe结构域是IgGlFc结构域。 在另一个实施方案中，至少一个IgGlFc结构域包含IgGlCH2和IgGlCH3。在另一实施方案 中，所述IgGlFc结构域还包含IgGl铰链。
[0019] 在一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，所述组合物包含多聚化斯塔都体，其 中所述斯塔都体从氨基到羧基末端包含Fab结构域、第一 Fe结构域、第一多聚化结构域、第 二多聚化结构域和第二Fe结构域。
[0020] 在一个实施方案中，本发明涉及一种斯塔都体，其中所述斯塔都体从氨基到羧基 末端包含Fab结构域、单一 Fe结构域、第一多聚化结构域和第二多聚化结构域。在另一实 施方案中，所述斯塔都体从氨基到羧基末端包含Fab结构域、单一 Fe结构域、异亮氨酸拉链 和IgG2铰链。在另一个实施方案中，所述斯塔都体从氨基到羧基末端包含Fab结构域、Fe 结构域、IgG2铰链和异亮氨酸拉链。在另一个实施方案中，所述斯塔都体从氨基到羧基末 端包含Fab结构域、Fe结构域和IgG2铰链。在另一个实施方案中，所述斯塔都体从氨基到 羧基末端包含Fab结构域、Fe结构域、IgG2铰链和第二IgG2铰链。在另一个实施方案中， 所述斯塔都体从氨基到羧基末端包含Fab结构域、Fe结构域和异亮氨酸拉链。在另一个实 施方案中，所述斯塔都体从氨基到羧基末端包含Fab结构域、Fe结构域、异亮氨酸拉链和第 二异亮氨酸拉链。在另一个实施方案中，所述斯塔都体从氨基到羧基末端包含Fab结构域、 Fe结构域、G4S结构域和IgG2铰链。在另一个实施方案中，所述斯塔都体从氨基到羧基末 端包含Fab结构域、Fe结构域、IgG2铰链和G4S结构域。在另一个实施方案中，所述斯塔都 体从氨基到羧基末端包含Fab结构域、Fe结构域、G4S结构域和异亮氨酸拉链。在另一个 实施方案中，所述斯塔都体从氨基到羧基末端包含Fab结构域、Fe结构域、异亮氨酸拉链和 G4S结构域。在另一个实施方案中，所述斯塔都体从氨基到羧基末端包含Fab结构域、Fe结 构域、结构域连接和IgG2铰链。在另一个实施方案中，所述斯塔都体从氨基到羧基末端包 含Fab结构域、Fe结构域、结构域连接和异亮氨酸拉链。在另一个实施方案中，所述斯塔都 体从氨基到羧基末端包含Fab结构域、Fe结构域、IgG2铰链和结构域连接。在另一个实施 方案中，所述斯塔都体从氨基到羧基末端包含Fab结构域、Fe结构域、异亮氨酸拉链和结构 域连接。在另一个实施方案中，所述斯塔都体从氨基到羧基末端包含Fab结构域、Fe结构 域和GPP结构域。在另一个实施方案中，所述斯塔都体从氨基到羧基末端包含Fab结构域、 Fe结构域、GPP结构域和IgG2铰链。在另一个实施方案中，所述斯塔都体从氨基到羧基末 端包含Fab结构域、Fe结构域、IgG2铰链和GPP结构域。在另一个实施方案中，所述斯塔都 体从氨基到羧基末端包含Fab结构域、Fe结构域、GPP结构域和异亮氨酸拉链。在另一个 实施方案中，所述斯塔都体从氨基到羧基末端包含Fab结构域、Fe结构域、异亮氨酸拉链和 GPP结构域。熟练技术人员将认识到可以使用其它多聚化结构域代替此处描述的多聚化结 构域。
[0021] 在另一实施方案中，所述Fe结构域是IgGlFc结构域。在另一实施方案中，所述 IgGlFc结构域包含IgGlCH2和IgGlCH3。在另一实施方案中，所述IgGlFc结构域还包含 IgGl铰链。
[0022] 在一个实施方案中，本发明涉及一种组合物，所述组合物包含多聚化斯塔都体，其 中所述斯塔都体从氨基到羧基末端包含Fab结构域、Fe结构域、第一多聚化结构域和第二 多聚化结构域。
[0023] 在另一个实施方案中，所述斯塔都体从氨基到羧基末端包含Fab结构域、两个或 更多个Fe结构域和一个或多个多聚化结构域。在另一实施方案中，所述Fe结构域是IgGlFc 结构域。
[0024] 在一个实施方案中，本发明涉及一种斯塔都体，其中所述斯塔都体从氨基到羧基 末端包含Fab结构域、第一 Fe结构域、一个或多个多聚化结构域和第二Fe结构域。在另 一个实施方案中，本发明涉及一种斯塔都体，其中所述斯塔都体从氨基到羧基末端包含Fab 结构域、第一 Fe结构域和一个或多个多聚化结构域。在另一实施方案中，所述斯塔都体还 在Fe区的C末端处包含一个或多个多聚化结构域。在另一实施方案中，所述Fe结构域中 的一个或多个是IgGlFc结构域。
[0025] 在一个实施方案中，本发明涉及一种斯塔都体，其包含Fab结构域、一个或多个Fe 结构域和一个或多个多聚化结构域，其中所述一个或多个多聚化结构域能够使所述斯塔都 体多聚化，且其中所述Fab结构域对EGFR具有特异性。在一个实施方案中，所述Fab结构 域的氨基酸序列与SEQ ID NO:31具有至少80%同源性。在另一实施方案中，所述Fab结 构域的氨基酸序列与SEQ ID NO:31具有至少90%同源性。在另一实施方案中，所述Fab 结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO:31具有至少95%同源性。在另一实施方案中，所述Fab 结构域的氨基酸序列与SEQ ID NO:31具有至少99%同源性。在另一实施方案中，所述Fab 结构域的氨基酸序列是SEQ ID N0:31。在一些实施方案中，所述一个或多个Fe结构域是 IgGlFc结构