诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非罗霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多 比星、链黑菌素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁和净司他丁；抗-代谢产物、诸 如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶（5-FU);叶酸类似物，诸如二甲叶酸、蝶罗呤和三甲曲沙；嘌呤 类似物，诸如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、和硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如安西他滨、 阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨和氟尿苷；雄 激素，诸如卡普睾酮、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷和睾内酯；抗-肾上腺、诸如米托 坦和曲洛司坦；叶酸补充剂，诸如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩 尿啼啶；安吖啶；bestrabucil ;双蒽生；依达曲沙；地磷酰胺；地美可辛；地吖醌；依佛鸟氨 酸；依利醋铵；埃博霉素；乙环氧啶；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；Ionidainine ;美登素类， 例如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇（mopidanmol) ;nitraerine ;喷司 他汀；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基酰肼；甲基苄肼；PSK多糖复合物； 雷佐生；根瘤菌素；西佐喃；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2, 2'，2"-三氯三乙基 胺；单端孢霉烯类（尤其是T-2毒素、疣孢菌素 A、杆孢菌素 A和蛇形菌素）；乌拉坦；长春 地新；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烧；gacytosine ;阿拉伯糖 苷（"Ara-C"）；环磷酰胺；紫杉烷类，例如，紫杉醇和多烯紫杉醇吉西他滨；6-硫鸟嘌呤； 巯嘌呤；钼配位络合物，诸如顺钼、奥沙利铂和卡铂；长春碱；钼；依托泊苷（VP-16);异环 磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺消灵（novantrone);替尼泊苷；依达曲沙；柔红 霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；伊立替康（例如，CPT-11);拓扑异构酶抑制剂RFS 2000 ;二氟甲基鸟氨酸（DMFO);类视色素，诸如视黄酸；卡培他滨；卡铂、丙卡巴肼、普卡霉 素、吉西他滨、诺维本、法呢基蛋白转移酶抑制剂、法呢基-蛋白转移酶抑制剂、反式铂和任 何上述物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
[0105] ii.放射疗法
[0106] 引起DNA损伤并且已被广泛使用的其它因素包括通常称为γ-射线、X-射线和/ 或放射性同位素至肿瘤细胞的直接递送。还设想了 DNA损伤因素的其它形式，诸如微波、质 子束辐照（美国专利5, 760, 395和4, 870, 287)和UV-辐照。最可能的是所有这些因素都 对DNA、对DNA的前体、对DNA的复制和修复以及对染色体的装配和维持造成广泛的损伤。X 射线的剂量范围为持续长时间（3至4周）的50至200伦琴的日剂量至2000至6000伦琴 的单次剂量。放射性同位素的剂量范围变化宽广，并且取决于同位素的半衰期、发射的辐射 强度和类型以及被赘生性细胞的吸收。
[0107] iii.免疫疗法
[0108] 本领域普通技术人员将理解，可将另外的免疫疗法与实施方案的方法组合或结合 使用。在癌症治疗的背景中，免疫治疗剂通常依赖于使用免疫效应细胞和分子来靶向并破 坏癌细胞。利妥昔单抗(Rituxan?)是这样的一个实例。免疫效应子可以是例如对于肿瘤 细胞表面上的一些标志物是特异性的抗体。所述抗体单独地可用作治疗的效应子或其可募 集其它细胞来实际上实现细胞杀伤。抗体还可被缀合于药物或毒素（化学治疗剂、放射性 核素、篦麻毒素 A链、霍乱毒素、百日咳毒素等）并且仅用作革El向剂。或者，所述效应子可以 是携带与肿瘤细胞靶直接或间接相互作用的表面分子的淋巴细胞。各种效应细胞包括细胞 毒性T细胞和NK细胞。
[0109] 在免疫疗法的一个方面，肿瘤细胞必须具有一些适合于靶向，即不存在于大多数 其它细胞上的标志物。许多肿瘤标志物存在并且这些标志物的任一种可适合于在本发明的 实施方案的背景中进行靶向。常见肿瘤标志物包括CD20、癌胚抗原、酪氨酸酶（p97)、gp68、 TAG-72、HMFG、唾液酸化路易斯抗原、1此4、11^、？1^、层粘连蛋白受体、6洸8和？155。免 疫疗法的另一方面是组合抗癌作用与免疫刺激作用。还存在免疫刺激分子，包括细胞因子， 诸如11^-2、几 -4、11^-12、61-05?、丫-正1趋化因子，诸如]\0?-1、]\〇3-1、11^-8和生长因子， 诸如FLT3配体。
[0110]目前处于研究或使用中的免疫疗法的实例是免疫佐剂，例如，牛型分枝杆菌 (Mycobacterium bovis)、恶性症原虫（Plasmodium falciparum)、二硝基氯苯和芳香族化 合物（美国专利 5, 801，005 和 5, 739, 169 ;Hui 和 Hashimoto, 1998 ;Christodoulides 等人， 1998);细胞因子疗法，例如干扰素 α、β和y、IL-l、GM-CSF和TNF (Bukowski等人，1998; Davidson 等人，1998 ;Hellstrand 等人，1998);基因疗法，例如，TNF、IL-l、IL-2 和 p53(Qin 等人，1998 ;Austin-Ward 和 Villaseca, 1998 ;美国专利 5, 830, 880 和 5, 846, 945);和单克 隆抗体，例如抗-⑶20、抗-神经节苷脂GM2和抗-pl85 (Hollander, 2012 ;Hanibuchi等人， 1998 ;美国专利5, 824, 311)。设想可将一种或多种抗癌疗法与本文中描述的抗体疗法一起 使用。
[0111] iv.手术
[0112] 约60%的具有癌症的人将经历相同类型的手术，所述手术包括预防性、诊断性或 分期性、治愈性和缓解性手术。治愈性手术包括其中癌症组织的全部或部分被物理除去、 切除和或破坏的切除，并且可与其它疗法诸如本发明的实施方案的治疗、化学疗法、放射疗 法、激素疗法、基因疗法、免疫疗法和/或替代疗法结合使用。肿瘤切除是指肿瘤的至少部 分的物理去除。除了肿瘤切除外，利用手术的治疗包括激光手术、冷冻手术、电外科手术和 用显微镜控制的手术（莫氏手术）。
[0113] 在癌性细胞、组织或肿瘤的部分或全部切除后，可在体内形成腔。所述治疗可通过 用另外的抗癌疗法对所述区域进行灌注、直接注射或局部敷药来实现。可以例如每1、2、3、 4、5、β或7天或每1、2、3、4和5周或每1、2、3、4、5、6、7、§、9、10、11或12个月重复此类治 疗。这些治疗同样可具有不同的剂量。
[0114] V.其它试剂
[0115] 设想可将其它试剂与本发明的实施方案的某些方面组合使用以改善治疗的治疗 功效。这些另外的试剂包括实现细胞表面受体和GAP连接、细胞生长抑制和分化剂、细胞粘 着的抑制剂、增强过度增殖细胞对细胞凋亡诱导剂的敏感性的试剂、或其它生物试剂的上 调。通过增加 GAP连接的数目产生的细胞信号转导的增加可增强对相邻过度增殖的细胞群 体的抗过度增殖作用。在其它实施方案中，可将细胞抑制或分化剂与本发明的实施方案的 某些方面组合使用以提高治疗的抗过度增殖的功效。设想细胞粘着的抑制剂改善本发明的 实施方案的功效。细胞粘着抑制剂的实例是粘着斑激酶（FAK)抑制剂和洛伐他汀。还设想 可将增强过度增殖细胞对细胞调亡的敏感性的其它试剂诸如抗体c225与本发明的实施方 案的某些方面组合来改善治疗功效。
[0116] III.试剂盒和诊断剂
[0117] 在实施方案的各个方面，预想试剂含有治疗剂和/或其它治疗剂和递送试剂。在 一些实施方案中，本发明的实施方案涉及用于制备和/或施用实施方案的疗法的试剂盒。 所述试剂盒可包含一个或多个装有本发明的实施方案的任何药物组合物的密封小瓶。所述 试剂盒可包括例如至少一种HER3抗体以及制备、配制和/或施用实施方案的组分或进行本 发明的方法的一个或多个步骤的试剂。在一些实施方案中，所述试剂盒还可包含适当的容 器，其为不会与试剂盒的组分反应的容器，诸如eppendorf管、测定板、注射器、瓶子或管。 所述容器可由可灭菌性材料诸如塑料或玻璃制造。
[0118] 所述试剂盒还可包括概述本文中所示的方法的流程步骤的说明书，并且将遵照与 本文中描述的方法大体上相同的方法或对于本领域普通技术人员来说是已知的。所述说明 书信息可存在于含有机器可读指令的计算机可读介质中，所述指令，当使用计算机执行时， 显示递送药物有效量的治疗剂的真实或实际流程。
[0119] IV.实施例
[0120] 下列实施例被包括来显示本发明的优选实施方案。本领域普通技术人员应当理 解，实施例中公开的技术遵循由本发明人发现的在本发明的实践中运行良好，从而可被认 为构成用于其实施的优选模式的代表性技术。然而，本领域普通技术人员根据本公开内容 应理解，可在不背离本发明的精神和范围的情况下在公开的特定实施方案中产生许多变化 并且仍然获得类似或相似的结果。
[0121] 实施例1-使用从抗原免疫的兔分离的HER3抗原结合血浆B细胞从噬菌体展示 Fab文库生成兔单克隆抗体
[0122] ErbB3 (Genebank 登录号 M34309)细胞外结构域（ECD)(氨基酸 Met 1-Thr643)蛋白 用于在 Bethyl laboratories, Inc (Montgomery, TX)免疫新西兰兔。用 100 μ g/兔给药免 疫兔。在初次免疫后，以2-3周的给药间隔施用2次加强给药。通过将HER3ECD蛋白涂覆 在96孔板（max-sorb板，Nunc)上，在ELISA中利用一系列血清稀释液测定抗-Her3血清， 并且利用缀合有辣根过氧化物酶（HRP)的抗-兔抗体和TMB底物检测结合抗体。将450nm 处的吸光度用于测定抗体血清滴度。当滴度达到>1〇6时，从免疫的兔取出全血样品，并使 用荧光辅助细胞分选（FACS)仪（BD FACSAria? III，BD Biosciences)从新鲜制备的兔外 周血单核细胞分离血浆B细胞（⑶45+⑶5-⑶19+)。进一步选择分离的血浆细胞中的HER3 结合细胞。在抗体生成B细胞富集后，分离总RNA，并按照制造商的建议，使用superscript 逆转录酶Π (Invitrogen)合成cDNA。使用一组设计的引物（表1)通过聚合酶链式反应 (PCR)扩增来自重链和轻链的抗体可变区的DNA序列，参见，例如，Ridder等人，2001 (通过 引用并入本文）。将扩增的DNA构建成噬菌体展示Fab表达载体（图2)并转化进大肠杆 菌（TGl)细胞。在噬菌体展示载体系统中构建IO8 9的文库大小，通过两轮富集淘选选择出 HER3特异性结合Fab，并对其进行测序（Lone Star Labs, TX)。在图1中举例说明了用于抗 体选择的方法流程。
[0123] 可将选定的HER3结合命中在兔中表达为全长IgG，和使用哺乳动物表达载体系统 将其在人胚胎肾（HEK293)细胞（Invitrogen)中表达为兔/人嵌合形式，并利用快速蛋白 液相色谱（FPLC)分离单元，使用蛋白G树脂进行纯化。表征纯化的HER3抗体的各种生物 学性质。
[0124] 表1.用于从兔血浆B细胞克隆可变重链和轻链cDNA序列的PCR引物组。
[0126] 实施例2 -利用流式细胞术和ELISA测量人和小鼠 HER3/ErbB3的结合
[0127] 将表达人或小鼠 HER3受体的CHO Flp-in (Invitrogen)细胞系用于研究HER3抗 体对细胞表面受体的结合。使用不含酶的Η)ΤΑ离解溶液分离表达HER3的细胞并将以约 IxlO6个细胞/ml的浓度将其重悬浮于PBS, 2% FBS中。在4°C用纯化的HER3IgG对细胞进 行染色40分钟，通过以1200rpm离心10分钟在含有2% FBS的PBS中洗涤细胞2次。除去 上清液，在4°C用缀合有R-PE的抗-兔IgG对细胞染色30分钟。随后用4mL含有2% FBS 的PBS洗涤细胞，在流式细胞仪（Quava，Millipore)上分析所述细胞。图3显示兔HER3抗 体对人和小鼠 HER3表达细胞的结合，如通过与非特异性兔IgG结合对照相比较荧光强度 (X-轴）的增加所指示的。
[0128] 实施例3 -利用Biacore T-100使用表面等离子体共振（SPR)测定进行的HER3 结合亲和力的测定
[0129] 以45 μ 1/分钟的流速在25°C进行所有实验。为了准备BIAcore测定，使用如由制 造商描述的胺偶联法将抗-兔IgG抗体（各自50 μ g/ml，于醋酸盐缓冲液，pH 5. 0中）固 定在羧甲基葡聚糖传感器芯片（CM5)上。将待测试的纯化的兔Mab以5 μg/ml的浓度稀释 于0. 5% P20, HBS-EP缓冲液中，并注射在FC2上以达到500至1000RU。将FCl用作参照细 胞。特定的信号对应于在FC2上获得的信号相对在FCl上获得的信号的差异。以在0.5% 卩20，耶54?缓冲液中的系列浓度稀释度（100、50、25、12.5、6.25和3.13、1.5611]\1)在90秒 时间内注射分析物（重组人HER3,在SDS-PAGE凝胶上的表观分子量为97kDa)。在0. 5% P20, HBS-EP中从原液制备这些浓度。在30分钟的时间内监测分析物的解离相。也在与双 参照相同的条件下注射电泳缓冲液。在每一个运行周期后，通过注射20至45μ1的甘氨 酸-HCl缓冲液pH 1. 5再生两种流动细胞。对HER3的结合Kd通过每一种HER3单克隆抗 体（表2)的koff/kon动力学速率来计算。
[0130] 表2.使用BIAcore (SPR)分析测定的对人HER3/ErbB3细胞外结构域的HER3抗体 结合动力学常数
[0132] 实施例4-HER3单克隆抗体的内化研究
[0133] 将T47D乳腺癌癌细胞培养至80 %的汇合。分离细胞，将其重悬浮于完全培养基 中以计数细胞。在2 μ g/ml的HER3IgG存在和不存在的情况下在37°C孵育浓度约IxlO7个 /ml的细胞，进行3小时。用4mL PBS，2% FBS洗涤细胞，并利用HER3抗体（10 μ g/ml)作 为一级结合抗体在4°C染色40分钟。在用PBS，2% FBS洗涤后，用0. 5 μ g缀合有R-PE的 山羊抗-兔抗体（BD Pharmingen)在4°C对细胞染色30分钟，用箱覆盖所述细胞。用4mL PBS，2%FBS洗涤细胞，随后以1200rpm离心10分钟。将细胞在PBS/10%甲醛中进行固定， 并使用流式细胞仪（Quava, Millipore)进行分析。通过下式计算由分离的HER3单克隆抗 体介导的HER3受体内化的百分比：（无抗体对照的平均荧光强度（MFI)-抗体处理的细胞 的MFI) /对照的MFI X 100,示于表3中。
[0134] 表3.由抗-HER3抗体介导的HER3受体内化的百分比
[0136] 实施例5 -兔HER3单克隆抗体对pHER3、pAKT和pERKl/2的抑制
[0137] 将MCF7细胞以约3xl〇5个细胞/ml的细胞密度接种在96孔板中，并培养过夜。将 细胞培养基更换成低血清（〇. 5% FBS)，进行15小时，在37°C利用分离的HER3单克隆抗体 处理细胞2小时。用3. 3nM rhNRGl-β 1在37°C刺激细胞20分钟，随后产生细胞裂解液。 在产生细胞裂解液之前，用冷PBS，0. 5% BSA洗涤细胞3次。在4°C在轻轻摇动下向每一个 孔中添加细胞提取缓冲液（含有新鲜的ImM PMSF、蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混 合物），进行30分钟。在通过上下移液3-5次将裂解液混合后，以3, OOOrpm将板离心10分 钟，在下列测定中使用细胞上清液。
[0138] 对于pHER3抑制测定，在4°C用4 μ g/ml的小鼠抗-人HER3抗体（R&D Systems) 涂覆maxi-sorp板（Costar 96孔板）过夜，在室温下用含2% BSA的PBS封闭板2小时。 将100 μ 1的细胞上清液转移至封闭的测定板，并在RT孵育2小时。用300 μ 1含有Tween 20 (0· 05% )的PBS洗涤板5次。随后添加二级抗体抗-P-酪氨酸-HRP (R&D Systems)并 在RT下孵育1小时，随后进行检测。重复洗涤步骤，在RT下在轻轻摇动下添加 HRP化学发 光底物（Millipore, CA)，进行5分钟，随后使用板读数器（Molecular Devices, CA)读取发 光信号。使用下式计算PHER3的抑制的百分比：（无抗体处理的细胞的信号-抗体处理的 细胞的信号）/对照的信号X 100。3-4个重复的平均值用于浓度依赖性抑制测定（图4)。 使用利用GraphPad prism(v5. 1)拟合的滴定曲线测定的IC5。示于表4中。
[0139] 对于pAKT抑制测定，使用来自R&D系统的抗体，将相似的ELISA格式用于捕获 总AKT蛋白。在用300 μ 1/孔的PBS-T洗涤板5次后，添加二级抗体生物素化兔抗-人 磷-Akt(S473)以在RT下孵育1小时。通过在RT下孵育20分钟，将链霉抗生物素蛋 白-HRP用于检测。在洗涤板后，添加 HRP化学发光底物，进行5-10分钟，并使用板读数器 (Molecular Devices)读取板。使用下式计算