近，它们之间的差值超过4°C。
[0063] (5)由于同时检测的病原较多，每种虫媒病都需设计多对引物和多条探针，还要避 免10对引物之间、引物对与模板之间、探针之间和探针与不同PCR产物之间的交叉反应，最 终从中筛选出表1、表2中的最佳引物对和探针。
[0064] 实施例2同时检测10种虫媒病病原的多重PCR检测体系的优化
[0065] 1、虫媒病病原RNA的提取使用QIAampViralRNAMinikit进行RNA提取，步骤参 见试剂盒说明书。
[0066] 2、多重不对称PCR体系的建立
[0067] 对dNTP浓度、酶量、退火温度等条件进行优化，尤其注重对上下游引物浓度比例 的反复优化。由于下游引物进行了Biotin标记，因此提高了带生物素标记物的单链DNA，以 此提高杂交效率。
[0068] 在不对称PCR反应中，按照上下游引物浓度的比例（1:1，1:2,1:3,1:4,1:5，）进行 PCR反应，然后进行杂交检测，进而确定适合单重和多重不对称PCR反应的最佳上下游引物 浓度比例。
[0069] 为确保得到最大量的生物素修饰的单链核酸，在10重不对称PCR反应中，按照不 同比例的上下游引物浓度同时进行PCR扩增反应，确保其他体系和条件不变的情况下进行 10重液相芯片方法的检测，进而确定最佳的上下游引物的浓度。结果显示10种不同编码 的磁性荧光微球读取的个数都不少于100个，并且空白对照和阴性参照的值都小于300,结 果表明计数的微球量有效，产生的荧光值可以进行分析，该试验结果可以进行判定，结果见 图1，从图中可看出来，RVFV、SBV、EBV、WNV、BTV的中位荧光值在1:2、1:3、1:4比例的时候 最高，基本都达到4000以上，荧光值高的甚至接近10000,BB、ASFV在这个体系当中的中位 荧光强度值是比较稳定，EHDV、VSV和QF在上下游引物为1:2时有最好的中位荧光强度值， 考虑到实验中为了降低成本，尽量用最小的量达到最佳效果，并且EHDV、VSV和QF上下游引 物浓度条件的限制，结论将比例上下游引物浓度设为1:2足以达到良好的检测效果。
[0070] 因此本实施例中，确定多重不对称PCR反应体系为：mixbuffer23μL，RNA模板 5. 0μL，10μmol/L上游引物各0. 5μL，10μmol/L下游引物各1. 0μL，不含RNA酶的ddH20 补足至50yLPCR扩增反应程序：50°C30min;95°C15min;95°C40s，54°C40s，72°Clmin(35 个循环）；72°C延伸10min，4°C保存。
[0071] 实施例3液相芯片的制备
[0072] 1、探针与微球的偶联
[0073] 按探针微球偶联的步骤将WNV探针与#27微球、BB探针与#28微球、ASFV探针与 #26微球、VSV探针与#64微球、BTV探针与#35微球、QFever探针与#43微球、RVFV探针 与#47微球、EBV探针与#21微球、EHDV探针与#52微球、SBV探针与#68微球进行偶联，具 体步骤如下：
[0074] (1)首先取出2支新鲜的EDC粉末放置室温（约lh)。
[0075] (2)取出10种不同颜色的微球（浓度为1. 25X107个/mL)室温静置，涡旋30s， 使微球悬浮达到充分混匀。
[0076] (3)各取200μL混匀的微球至L5ml的棕色EP管中，14000g离心3-5min后放到 InvitrogenBeadSeparation(磁珠分离器）中，短暂停留，吸出上清。
[0077] (4)加入50μL0· 1MMES(pH= 4. 5)重悬微球，振荡20-30s，然后用超声清洗仪 超声微球20s。
[0078] (5)各加入实施例1的表2中记载的10种不同的探针（非验证探针）3yL(浓度 为0.lnmol/μL的存液）于微球中，振荡混勾，超声微球20s。
[0079](6)每个棕色EP管反应中加入2. 5μL新鲜配制的EDC溶液（10mg/mL)，迅速涡旋 混匀，室温避光放置30min，注意EDC溶液用分子生物级水配制且保存期为30min。
[0080] (7)每个反应中再次加入2. 5μL新鲜配制的EDC溶液（10mg/mL)，迅速涡旋混匀， 室温避光放置30min。
[0081] (8)向每个反应中加入lmLO. 02 %的Tween-20溶液，短暂涡旋，全速离心2min后 放置磁力架中，吸出上清。
[0082] (9)向反应中加入lmLO. 1 %的SDS溶液洗涤微球，重悬振荡40s，全速离心2min后 放置磁珠分离器中，吸出上清。
[0083] (10)用100μLTE溶液（pH= 8. 0)重悬微球，涡旋超声各30s，4°C保存备用
[0084] (11)取1μL微球进行100倍的稀释，振荡混匀，取10μL微球稀释液于血球计数 器上计数，要求每种微球的数量不能少于5000个。
[0085] 2、探针与微球的偶联效率的验证
[0086] (1)首先取出存浓度为100μΜ(即为lOOpmol/μL)的验证探针 (rc-Probe-Biotion)，参见实施例1中的表2,按10倍的梯度依次稀释成lOpmol/μL、 lpmol/yL、100fmol/yL、10fmol/yL、lfmol/yL不同浓度的验证探针，置于冰上备用。
[0087] (2)取出相对应的本实施例步骤1中已偶联探针的微球，振荡混匀和超声处理各 30s〇
[0088] (3)用1XTMAC杂交液将各组微球稀释至1μL中不少于lOObeads的微球的混合 液。
[0089] (4)在标准的PCR八连排管中，按表3加入不同浓度的生物素标记的验证探针 1μ1、微球的混合液和TEBuffer，充分混匀，做3个复孔。
[0090] 表3探针、微球混合液和TEBuffer的加入量
[0091]
[0092] (5)将PCR八连排管放置PCR仪，95°C变性5min，54°C杂交30min，4°C保持。
[0093] (6)将PCR八连排管中的反应液转移至96孔ELISA板中，注意避免产生气泡，放置 到磁力架上吸附磁性微球，弃去液体。
[0094] (7)同时将 1XTMAC杂交液与报告缓冲液Streptavidin-R-Phy-coerythri(SA-PE)进行1000 :3倍稀释现配，每孔加入约100μL报告缓冲液重悬微球。
[0095] (8)用铝箱封住ELISA板，在金属浴中58°C避光孵育lOmin。
[0096] (9)ELISA板放入预先经过预热、校正和校验良好的Bio-Plex液相芯片检测系统 中进行分析，注意调整检测样品大小为100U1且范围为100种微球，最后根据中位荧光强度 值（MFI)来判断微球与探针的偶联效率。
[0097] 上述方法中，利用与探针反向互补并经生物素标记的验证探针作为阳性，Ofmo1~ lOOOfmol浓度稀释后与微球偶联的捕获探针杂交，检测偶联的效率。结果显示针对10个基 因的验证探针和各自的捕获探针均具有较高的杂交信号，且荧光强度中位值大小随着验证 探针浓度的从高到低而依次逐渐下降呈现出一定的梯度，说明探针与微球偶联成功。
[0098] 实施例4杂交体系与反应条件的优化
[0099] 1、杂交检测
[0100] 将实施例2获得的虫媒病毒的PCR产物与实施例3制得的偶联有各个病毒探针的 微球进行液相杂交检测，同时设计空白对照和阴性对照，步骤如下：
[0101] ⑴选取1〇种不同的微球探针偶联组合，分别涡旋和超声各30s，使微球悬浮均 匀。
[0102] (2)配制混合微球工作液：每330ul1XTMAC杂交缓冲液加10种偶联微球各 1μ1，再次振荡和超声处理各30s以混匀工作液。
[0103] (3)向PCR八连排每个反应管中分别加入33μL混合的微球工作液和16μL的TE Buffer(pH= 8. 0)。向空白对照管中加入lul的ddH20;向阴性对照管中加入1μL的PCR 阴性扩增产物；向阳性对照管中加入与微球偶联探针组合对应的验证探针各1μL(浓度为 0. 01μmol/L);向样品检测管中加入1μL阳性PCR产物，每个做3个复孔，然后用移液枪轻 轻吹打，充分混匀。
[0104] (4)将上述各管置于PCR仪中，95°C5min使PCR产物变性，54°C杂交30min，4°C保 持。
[0105] (5)将PCR八连排管中的杂交反应液转移至96孔ELISA板中，注意避免产生气泡， 将板放置到磁力架上吸附磁性微球，约lmin左右，弃去液体。
[0106] (6)同时将 1XT