系，将2 X Super Real Pre Mix Plus 10μ1、50 X ROXReference Dye -、模板_，正、反向引物各0.6μ1和RNase-Free ddH20补足至20μ1混合，在室温下平衡并彻底混匀，离心。设置荧光定量检测仪进行检测；
(2)PCR步骤建立20 μ?反应体系，将Template<lyl、Primer 1 ΙμΚPrimer 2 Ιμ?、2XTaq PCR MasterMix 12.5μ1、RNase_Free ddH20补足至25μ1 混合均匀；
(3)PCR反应循环的设置:反应条件设置为94°C3 min、94°C 30 sec、56°C 15 sec,72°C 30 sec、72°C 5 min，以上反应条件进行34个循环；
(4)琼脂糖凝胶电泳检测成肌细胞基因样品顺序:0-3(31:;[11、3(^2、0(^4、似1108、CD133、CD45;VSELs基因样品顺序:CD45、CD133、Nanog、Oct4、Sox2、0-actin。图8荧光定量RT-PCR基因水平检测示VSELs高表达Nanog、0ct4、Sox2，而成肌细胞低表达；图9凝胶电泳图显示VSELs胚胎样标记物表达水平显著高于成肌细胞。
[0029]以上所述仅为本发明的主要实施方式，凡依本发明申请专利范围所作的均等改进和润饰也应视为本发明专利的涵盖范围。
【主权项】
1.一种猪极小胚胎样干细胞的体外培养方法，其特征在于，将分离、纯化后得到的猪骨髓极小胚胎样干细胞接种于铺有成肌细胞饲养层的培养板中，用RPMI 1640培养基进行培养，置于37°C、5% C02的培养箱中，并添加双抗(青-链霉素储存液)、白血病抑制因子(LIF)、碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)、干细胞因子(SCF)等细胞因子进行培养，每2天更换1次培养液，培养9至11天可以进行传代。2.根据权利要求1所述的猪极小胚胎样干细胞的体外培养方法，其特征在于，所述的双抗(青-链霉素):取青、链霉素各100万单位溶于lOOmLPBS缓冲液中。3.根据权利要求1所述的猪极小胚胎样干细胞的体外培养方法，其特征在于，所述的成肌细胞饲养层，其制备包括如下步骤: 一是乳猪成肌细胞分离，步骤包括: (1)将乳猪麻醉后，无菌条件下分离新生乳猪的骨骼肌样本，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗，并尽量剔除表面结缔组织； (2)将骨骼肌组织样本置于离心管中，剪成1mm3的块状，加入lg/L的胶原蛋白酶Π，置于37 °C恒温水浴中消化，20?40分钟后，1200 rpm离心6分钟，弃上清； (3)加入0.25%胰酶消化液，轻微吹打3?5分钟，可见消化液变浑，此时取上清液于另一干净的试管中，加入等体积含有10?15%胎牛血清的DMEM终止消化，剩余组织可重复消化1次； (4)轻轻吹打细胞悬液，吹散细胞，用400目过滤筛过滤，1200rpm离心6分钟，弃去上清液，用新鲜DMEM液洗2?3次，1200 rpm离心6分钟； (5)用10?15%胎牛血清+10%马血清的F12培养基重悬细胞，接种于培养皿中，至于培养箱中培养； (6)培养1.5?2小时后，将上清液移于另一培养皿中继续培养，以去除非肌原性细胞； (7)培养5?6天，细胞生长至80%贴壁，可以进行传代； (8)弃去培养基，用PBS清洗细胞3次，加入适量0.25%胰酶消化3?5分钟，用含有10%胎牛血清的培养基终止消化，1200 rpm离心6分钟，用培养基重悬细胞，接种于培养皿中，置于37 °C，5 % C02培养箱中继续培养;40分钟后，将含细胞的上清液移于另一培养皿中继续培养； 二是乳猪成肌细胞饲养层制备，步骤包括: (1)将传至3代细胞的培养基吸出，加入适量丝裂霉素C溶液，置于培养箱中培养1?2小时后，弃去丝裂霉素C溶液，用PBS清洗7?8次，加入适量0.25%胰酶消化3?5分钟，用含有10 %胎牛血清的培养基终止消化，1200 rpm离心6分钟，用培养基重悬清洗细胞2次，1200 rpm离心6分钟，培养基重悬细胞，接种于96孔板中，置于培养箱中培养； (2)观察到细胞融合至60%左右，即获得成肌细胞饲养层。4.根据权利要求3所述的猪极小胚胎样干细胞的体外培养方法，其特征在于，所述的乳猪为出生2-4天的乳猪。5.如权利要求3所述的所述的猪极小胚胎样干细胞的体外培养方法，其特征在于，所述的0.25%胰蛋白酶，是将0.25g胰蛋白酶溶于lOOmLPBS缓冲液中，调整PH值至7.2，使用0.22um微孔滤膜过滤除菌，分装后置于-20°C环境中备用。6.根据权利要求3所述的猪极小胚胎样干细胞的体外培养方法，其特征在于，所述的PBS缓冲液(不含Ca、Mg):取Na2HP04.12H20 1.4425g，KH2P04 0.1g，NaCl 4g，KCl 0.lg，溶解于500mL新制备的超纯水中，定容后调整PH至7.2，高压灭菌后，4°C环境中保存。7.根据权利要求1所述的猪极小胚胎样干细胞的体外培养方法的鉴定方法，其特征在于，用透射电镜鉴定所述的猪VSELs，步骤包括:将分离或培养后的⑶45 (-)⑶133 ( + )lin (-)的单核细胞收集、固化、包埋进行透视电镜观察细胞形态和超微结构。8.根据权利要求1所述的猪极小胚胎样干细胞的体外培养方法的鉴定方法，其特征在于，用免疫荧光鉴定所述的猪VSELs，步骤包括: (1)将分离或培养后的VSELs培养液从培养孔板中吸出，加入4 %多聚甲醛固定细胞30min，PBS润洗3次;0.2% Triton X -100透膜处理20min，PBS润洗3次；含 10% FBS的PBS封闭2小时； (2 )分别在不同孔中加一抗SSEA-1、S0X-2、OCT-4、NAN0G，4°C冰箱过夜； (3)过夜细胞孵育后，分别加入相对应的二抗;添加0.5%Tween 20的溶液(PBS-T)润洗3次，每次5分钟，滴加二抗，37°C温育2小时(避光);PBS-T润洗3次，每次5分钟； (4 )5ng/yL DAPI常温下染色2分钟； (5)荧光显微镜观察； (6)碱性磷酸酶(AKP)染色将荧光染色后的细胞孔板中的培养液吸出，加入配置好的碱性磷酸酶染色液，放在倒置显微镜下观察。9.一种猪极小胚胎样干细胞的鉴定方法，其特征在于，用基因水平鉴定猪VSELs，步骤包括: 一.RNA提取 (1)先将细胞悬液收集至离心管中，lOOOrpm，6-8分钟，之后用重悬细胞，重复三遍以达到清洗细胞的目的，按1 X 107细胞加入lmL TRIZ0L试剂； (2)将上述样品于15-30°C(常规室温即可)静置5分钟，使蛋白质充分解离； (3)加入0.2mL氯仿，盖紧盖子，充分剧烈振荡15秒并于15-30°C静置2-3min; (4)于2-8°C12000rpm离心15min ；离心后样品分层，上层水相中含RNA，下层有机相中含蛋白和DNA; (5)取上清，加入0.5mL异丙醇，轻轻混匀，于15-30°C静置lOmin后，在管底会出现胶状沉淀，即为RNA; (6)于4°C12000rpm离心lOmin后，弃上清; (7)向沉淀中加入lmL75%乙醇，轻轻混匀； (8)于4°C7500rpm离心5min后，弃上清； (9)将RNA样品晾干，加入适量去离子甲酰胺溶解(可于55-60°C促溶lOmin); 二.反转录制备cDNA (1)gDNA去除反应体系:将5XgDNA Buffer 2μ1、Total RNA -、RNase_FreeddH20补足至10μ 1混合均匀，简短离心，于42°C孵育3min，至于冰上备用； (2 )反转录反应体系:将 lOXFast RT Buffer 2yl、RT Enzyme Mix lpUFQ-RTPrimer Mix 2μ1、RNase_FreeddH20补足至 10μ1 混合； (3)将反转录反应体系中的Mix加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混匀； (4)42°C孵育15min，95°C孵育3min，得到的cDNA用于后续实验，或-20°C保存； 三荧光定量PCR (1)建立20μ?反应体系，将2 X Super Real Pre Mix Plus 10μ1、50 X ROX ReferenceDye _、模板_，正、反向引物各0.6μ1和RNase-Free ddH20补足至20μ1混合，在室温下平衡并彻底混匀，离心;设置荧光定量检测仪进行检测； (2)建立20 μ? 反应体系，将 Template <lyl、Primer 1 lyl、Primer 2 1μΚ2 X TaqPCR MasterMix 12.5μ1、RNase_Free ddH20补足至25μ1 混合均匀； (3)PCR反应循环的设置:反应条件设置为94°C3 min、94°C 30 sec、56°C 15 sec,72°C 30 sec、72°C 5 min，以上反应条件进行34个循环； (4)琼脂糖凝胶电泳检测成肌细胞基因样品顺序:0-&(:1:;[11、5(?2、0(^4、他1108、0)133、CD45; VSELs 基因样品顺序:CD45、CD133、Nanog、Oct4、Sox2、0-actin。
【专利摘要】本发明涉及干细胞培养与鉴定技术领域，尤其涉及一种偶蹄类动物猪极小胚胎样干细胞的培养与鉴定方法，技术内容包括：1.分离同种乳猪成肌细胞并制备成肌细胞饲养层；2.接种分离的猪骨髓极小胚胎样干细胞于成肌细胞饲养层，用RPMI？1640培养基进行培养，并添加细胞因子进行培养扩增极小胚胎样干细胞；3.采用形态学、免疫荧光和基因水平系列鉴定极小胚胎样干细胞。发明提出的极小胚胎样干细胞的高效培养方法和精准的鉴定步骤具有巨大的应用前景，为极小胚胎样干细胞的进一步研究提供了重要的技术保障。
【IPC分类】C12N5/077, C12N5/074, C12Q1/68
【公开号】CN105441386
【申请号】CN201510985992
【发明人】顾翔, 李碧春, 顾健, 孙加斌, 金凯, 蒋一秀, 罗雪, 朱业, 孙磊, 胡茂志, 石青青, 朱睿, 王竟悟, 顾艺荀, 苗书航
【申请人】江苏省苏北人民医院
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2015年12月25日