（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning:a laboratory manual ,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。 [0031 ]实施例1含GUS报告基因的转基因材料的获得
[0032]以水稻品种中花ll(ZHll)为例，将携带⑶S报告基因序列（SEQ ID N0:3)的载体， 如DX2182植物双元表达载体，通过农杆菌介导的遗传转化法转化水稻的愈伤组织中，利用 潮霉素抗性筛选，经分化、生根获得阳性转基因植株。
[0033]实施例2含⑶S报告基因的转基因材料的检测
[0034] 1、引物的设计与合成
[0035]以⑶S基因序列（SEQ ID勵:3)为依据，利用软件?^111從5设计一对(；1^基因内部引 物⑶S(DX)F1:5 '-TCAGTGGCAGTGAAGGG-3 ' ；⑶S(DX)R1:5 '-GAGCGTCGCAGAACATTA-3 '。引物扩 增片段长度538bp。
[0036] 2、提取 DNA
[0037] 随机抽取11株ZH11水稻抗性植株并选取非转基因水稻品种ZH11、日本晴、 0〇1^"11、93-11、1!163，分别提取基因组0嫩。0嫩提取步骤如下 ：取约2〇11长的水稻叶片置于 2ml离心管中；在研钵中加入800μ1 1.5 X CTAB，研磨叶片至匀浆并倒回离心管内；65°C水浴 20-30min，每5min颠倒混匀1次；加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1)，上下颠倒混匀，持续 10111；[11;10000印1]1离心10111；[11;吸取40(^1上清液至新的离心管，加入2倍体积经冰预冷的95% 乙醇，-20°C冰置20min; 12000rpm离心15min;弃上清，加入500μ1 75 %乙醇，颠倒漂洗， 12000rpm离心5min;弃上清，置于超净台吹干或自然瞭干，加 100μΙ ddH20溶解DNA。
[0038] 3、转基因水稻的检测
[0039]以⑶S(DX)F1/R1为引物，分别以ZH11水稻抗性植株基因组DNA(待检测样品），转化 所用质粒DNA(阳性对照），非转基因 ZH11基因组DNA(阴性对照)为模板，进行PCR扩增。PCR反 应程序和体系如下：
[0040] PCR反应体系以 20μ1计为：10 X PCR反应缓冲液(Mg2+Plus) 2μ1; dNTPs (各2.5mM) 1μ 1;10μΜ正向引物 1μ1;10μΜ反向引物0·5μ1;模板DNA 2μ1;?υ/μ1 Taq DNA聚合酶0·5μ1; ddH20 补足至 20μ1。
[0041 ] PCR反应程序为:95°C5分钟；94°C30-45秒，55°C30-45秒，72°C 1.5分钟，共30-35个 循环;72°C10分钟。
[0042] PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳，结果见图1。电泳结果表明阳性对照中含有 538bp条带，符合⑶S基因预期扩增长度;而转基因水稻中不仅有538bp的⑶S基因扩增条带， 还有一大小约1500bp的条带，阴性对照中同样有该条带，推测该条带为水稻基因组中特有 序列。
[0043 ]实施例3水稻基因组检测内参基因的获得 [0044] 1、分子标记序列的验证
[0045]为了进一步验证该约1500bp条带是否为水稻基因组特有序列，分别选取粳稻和籼 稻代表品种(ZH11、日本晴、0〇即]_丨11、93-11、1册3)，以其基因组0嫩为模板，61^(0乂奸1/1?1为 引物，进行PCR扩增，PCR产物电泳后也含有大小约1500bp的条带，如图2所示，进一步确定该 序列为水稻基因组中特有序列。因此，该序列可作为GUS基因扩增检测的水稻基因组内参基 因，标示水稻基因组的质量。
[0046] 2、克隆及分析内参基因序列
[0047]为了进一步确定该约1500bp片段特征，将上述约1500bp片段割胶回收，取2μ1进行 PCR电泳检测目的片段回收质量，剩余的目的片段连接到pGEM?-T载体(Promega)，连接 体系为1〇μ1，其中T载体100ng，目的片段200ng，10 X连接反应缓冲液ΙμL，T4DNA连接酶0.5μ 1;22°C连接3小时后转化大肠杆菌DH5a，涂布含氨苄抗性的LB平板，经蓝白斑筛选，12小时 后挑取白色单克隆菌斑进行菌液PCR检测;PCR程序及体系同实施例2。将符合目的片段大小 的单克隆菌液送华大基因测序。测序表明该序列长1491bp，用该序列在Genbank数据库中进 行BLAST，比对结果发现，在现有的基因库中，该序列仅存在于水稻属，同源性均在90%以 上，证明该序列的确为水稻基因组特有序列，其序列如SEQ ID N0:4所示。该序列位于3号染 色体，靠近中心粒区域，覆盖了两个预测的编码蛋白的两端(AAS01940.1和AAS01917.1)。其 中AAS01940.1可能编码一个天冬氨酸蛋白酶，AAS01917.1可能编码一个转座酶，二者均为 预测蛋白，其编码序列属新基因，有待进一步验证该基因的功能。
[0048] 实施例4引物的灵敏度检测实验
[0049] 随机选取一株水稻ZH11转基因植株，提取DNA，用NanoDrop 2000 (Thermo)检测DNA 浓度为403.6μg/ml。将DNA样品进行10倍梯度稀释，依次为浓度梯度，于-20°C保存 备用。
[0050] 分别以上述进行浓度梯度稀释的DNA样品为模板，进行PCR反应，PCR反应体系及程 序同实施例2。
[0051 ] 取5μ1 PCR产物，经1.2%琼脂糖凝胶电泳，检测结果中如果出现538匕？条带和 1491bp条带则证明所检测的样品为ΖΗ11转基因植株，如果无条带则说明样品浓度过低。 [0052] PCR反应的电泳检测结果见图3,泳道1-8均为ZH11转基因植株样品，当浓度稀释到 1〇_5倍时条带不明显，稀释至1〇_ 6倍时未扩增到条带。因此，该引物的灵敏度可达4.036ng/ ml，即可检测出约2pg的水稻DNA，检测灵敏度较高。
[0053]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 含GUS报告基因的转基因材料的PCR检测引物，其特征在于，其包括： 正向引物:5 ' -TCAGTGGCAGTGAAGGG-3 ' 和 反向引物:5 ' -GAGCGTCGCAGAACATTA-3 '。2. 含有权利要求1所述引物的用于检测含GUS报告基因的转基因材料的试剂盒。3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、TaqDNA聚合 酶、Mg2+、PCR反应缓冲液、标准阳性模板中的至少一种。4. 权利要求2或3所述试剂盒在检测含GUS报告基因的转基因材料中的应用。5. 含GUS报告基因的转基因材料的PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 提取待测样品中的DNA; 2) 以步骤1)中提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的引物进行PCR扩增反应； 3) 分析PCR产物。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，PCR反应体系以20μ1计为:含Mg2+的10 X PCR 反应缓冲液2μ1;各2.5mMdNTPs 1μ1;10μΜ正向引物1μ1;10μΜ反向引物0.5μ1;模板DNA 2μ 1;?υ/μ1 Taq DNA聚合酶0.5μ1;(ΜΗ2〇补足至20μ1; PCR反应程序为：95°C5分钟；94°C30-45秒，55°C30-45秒，72°C1.5分钟，共30-35个循 环;72°C10分钟。7. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述转基因材料包括转基因水稻、玉米、小 麦、大_&、棉花。8. 根据权利要求5-7任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)中对PCR产物进行琼脂糖 凝胶电泳，如果只扩增出一条538bp大小的条带，则表明该样品为含GUS报告基因的转基因 材料，但遗传背景并非水稻;如果同时扩增出538bp和1491bp大小的两条条带，则表明待测 样品为含GUS报告基因的转基因水稻;如果只扩增出一条1491bp大小的条带，则表明该样品 为非转基因水稻。9. 水稻基因组检测内参基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示。10. 用于扩增权利要求9所述内参基因的特异性PCR引物，其特征在于，其包括： 正向引物:5 ' -TCAGTGGCAGTGAAGGG-3 ' 和 反向引物:5 ' -GAGCGTCGCAGAACATTA-3 '。
【专利摘要】本发明提供一对用于检测含GUS报告基因的转基因材料的PCR引物，是根据GUS基因序列设计的一对引物，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO:1和2所示，该对引物不仅能通过传统定性PCR方法检测转基因材料中的GUS报告基因片段(SEQ？ID？NO:3)，同时能扩增出水稻基因组中特有的一段序列(SEQ？ID？NO:4)，因此可同时作为检测水稻基因组DNA的内参基因标记。本发明提供的PCR检测引物及检测方法，既可用于检测含GUS报告基因的转基因样品，又可用于确定模板基因组DNA是否来源于稻属及其基因组DNA的质量。该方法简单、快捷，成本低，实验结果直观清晰。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105483252
【申请号】CN201511029010
【发明人】黄培劲, 安保光, 李亚梅, 陈思兰, 欧阳超
【申请人】海南波莲水稻基因科技有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年12月31日