与芳族碳C-l'（SC138.7)，C-2'，6'（δα?7.3)和季碳C-6(SC124.1)交叉 峰表明单取代的苯环和另一环状部分由烯胺功能团连接起来。HMBC谱中Η-9与C-l，C-5，C-6 和C-Γ的相关性验证了上述推论。N0ESY谱中H-9与甲基CH 3-8的相关性表明烯胺为Z构型。 综合氢谱、碳谱、HMBC谱和N0ESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物 如图1所示，立体构型进一步通过E⑶试验确定，理论值与实验值基本一致(图2)。
[0025]实施例2:化合物（I)药理作用试验 [0026] -、材料和仪器
[0027] 786-0肾癌细胞株、0S-RC-2肾癌细胞株均购自中科院细胞库。化合物（I)自制， HPLC归一化纯度大于98% APMI-1640培养基、100U/mL青霉素及100yg/mL链霉素、1 X PBS缓 冲液、胰酶-EDTA购于美国HyClone。胎牛血清购于美国Gibco。细胞增殖与毒性检测试剂盒 (中国）。基质胶购于美国BDBioscience。
[0028] HERAcell240i恒温孵箱、GmbHD-37520低温离心机、1510酶标仪为芬兰Thermo公司 产品。頂T-2倒置相差显微镜为日本Olympus公司产品。DFC480正置显微镜为德国徕卡公司 产品。MDF-U53V-80°C超低温冰箱为日本SANYO公司产品。YDS-50B-80液氮储存罐购自中国 成都液氮容器厂。BC-185GE 4°C冰箱为中国益友公司产品。Minispinplus小离心机为 Eppendorf公司产品。powerpac300电泳仪为美国Biorad公司产品。Las4000mini凝胶成像仪 为日本FUJIFILM公司。
[0029]二、试验方法 [0030] 1、细胞培养
[0031] (1)常规培养及细胞传代:786-0及0S-RC-2肾癌细胞株均培养在改良型RPMI-1640 培养基中，常规培养时加入了10%胎牛血清及1 %青霉素和链霉素，构成完全培养基。培养 条件为37°C、5%C02的恒温培养箱。正常情况下786-0及0S-RC-2细胞均为贴壁生长。每天在 倒置相差显微镜下观察细胞生长情况，一般隔天换液一次。换液时先吸去培养瓶或培养皿 中培养基，加 PBS洗漆2次后再加入完全培养基。细胞密度达到80-90 %且细胞形态仍保持良 好时进行传代，传代周期一般为3天。细胞传代步骤如下：1)先弃去培养瓶内培养基，PBS洗2 次;2)培养瓶内加 lmL胰蛋白酶-EDTA，37°C孵育约3分钟，倒置显微镜下观察细胞变圆并脱 落后，加入3mL完全培养基终止消化，并用吸管将成团的细胞吹散;3)细胞悬液移至15mL离 心管中，1000转/分离心5分钟，弃去上清，加入完全培养基吹散细胞沉淀，分装到3个培养瓶 中，置于37°C、5%C0 2中继续培养。
[0032] (2)细胞冻存:细胞处于对数生长期，状态良好并且细胞密度达到80-90 %冻存细 胞，步骤如下：1)配制细胞冻存液:将改良型RPMI-1640培养基、胎牛血清、DMS0按7:2:1比例 混合、震荡混匀;2)消化、离心细胞(具体见细胞传代步骤）；3)离心后吸去上清液，加入冻存 液并吹匀，调整细胞计数约1 X 107mL，移至1.2mL冻存管中。在冻存管标记冻存日期及细胞 株信息，用封口膜封口。置于4°C冰箱30分钟，移至-20°C冰箱2小时，再移至-80°C冰箱过夜， 次日转入液氮中保存。
[0033] (3)细胞复苏：1)水浴锅预热到37 °C准备;2)从-80 °C冰箱或液氮中取出细胞，迅速 放入37°C的水浴锅中并摇动，使其内液体在1-2分钟内融化；3)将融化后的细胞悬液移置 15mL离心管中，1000转/分钟离心5分钟，离心后弃去上清并加入完全培养基。4)将细胞置于 37 °C、5 % C02培养箱中培养，次日观察细胞状态并换液。
[0034] (4)细胞计数:1)细胞消化，吹散制备细胞悬液，方法同细胞传代。用加样器吸取20 yL悬液沿盖玻片边缘烧靠外侧滴加，使悬液由于气压影响均匀吸入计数察，健康活细胞呈 规则圆形、透明状。计算计数板4个角的4大格内细胞数(格子边线上的细胞只记上边、不计 下边；只记左边、不记右边）。细胞密度=4大格细胞总数X 0.25 X 107mL。
[0035] 2、细胞增殖曲线绘制
[0036] (1)当786-0及0S-RC-2细胞处于对数生长期，密度80-90 %时，制备细胞悬液并细 胞计数，方法同上。调节细胞悬液浓度为1 X 105/mL; (2)接种细胞悬液lmL接种于于24孔板 上，然后再根据不同条件加药，保证每孔细胞数基本一致。同一种细胞同一种加药条件设计 计数6天，每天计数3个孔，即每种条件需设置18个孔；（3)将培养板置于37°C、5%C0 2中培 养；（4)从接种次日开始计数，记为第1天(第0天细胞数记为接种细胞数，即IX 105)。每孔加 200yL胰酶-EDTA，消化、吹散、计数即可。每隔24小时取3个孔进行细胞计数；（5)根据计数所 得数据绘制细胞生长曲线。
[0037] 3、WST_8细胞活力实验
[0038] (1)收集对数生长期的786-0及0S-RC-2细胞，制备细胞悬液、细胞计数，方法同上。 调节细胞悬液浓度为4 X 104mL; (2)每孔中加入50yL细胞悬液（即2000个细胞/孔），然后各 逾加入含有设计值2倍浓度药物的完全培养基50yL混勾，这样使药物终浓度恰好为设计值， 且保证了各孔细胞数的一致性。每个条件设置5个复孔；（3)将细胞置于5%C0 2、37°C条件下 的细胞培养箱中孵育；（4)分别在24小时和48小时后终止培养，吸取孔内培养基，更换新鲜 完全培养基，每孔加入l〇yLWST-8溶液，用加了新鲜完全培养基和WST-1溶液但没有接种细 胞的孔作为空白对照；（5)避光条件下置于摇床5分钟摇勾，后继续放入37°C、5%C0 2条件下 培养箱中培养1小时；（6)酶标仪下测定450nm吸光度值；（7)细胞活性抑制率=(对照组吸光 度值-实验组吸光度值)/(对照组吸光度值/空白组吸光度值）X 100%。
[0039] 4、划痕细胞迀移实验
[0040] (1)准备无菌6孔细胞培养板，marker笔在6孔板背面每隔1 cm划一道标线；（2)取对 数生长期细胞，PBS液洗漆2次，0.25 %胰蛋白酶消化、吹散，将细胞悬液离心，更换完全培养 基重悬。接种于标记好的6孔培养板中培养，每孔加5 X 105细胞；（3) 37 °C、5C02培养，待倒置 相差显微镜下观察各孔细胞密度约达到90 %时吸取完全培养基，换用无血清培养基培养24 小时，以消除由于血清引起的增殖对迀移作用的干扰；（6)无血清培养到指定时间后用高压 消毒的200yL枪头垂直6孔板上的标记线划痕。划痕与孔板上mark笔上的横线交叉点即为观 察的固定点。（7)PBS清洗2次洗去划下的细胞。更换新鲜的无血清培养基，按照实验条件在 各组培养基中加入相应浓度的药物，同时设立对照组，置37 °C、5C02孵箱中培养；（6)每个孔 取8个固定点观察划痕后12h、18h的细胞迀移情况并照相，使用Image J图像分析软件测定每 张图片划痕区的面积；（8)迀移率=(观察时间固定点划痕面积-起始时间固定点划痕面 积)/起始时间固定点划痕面积X 100%。迀移抑制率=(实验组迀移率-对照组迀移率)/实 验组迀移率XI00 %。
[0041 ] 5、Transwell细胞侵袭实验
[0042] (1)取培养在完全培养基中的对数生长期786-0和0S-RC-2肾癌细胞株，PBS洗漆2 次，换用无血清的RPMI-1640培养基培养12小时，以减少细胞增殖对侵袭实验的影响；（2)准 备Transwell小室。小室可搭置于24孔细胞培养板上，底面为直径6.5mm、孔径5μηι的膜。取40 yL以1:5稀释的lmg/mL基质胶铺在上室，并放入4°C过夜风干，该操作需在冰上完成，因基质 胶在室温下易迅速凝固；（3)786-0和0S-RC-2肾癌细胞株经无血清RPMI-1640培养基培养到 12小时后，胰酶-EDTA消化、离心后吸去上清，加入无血清的RPMI-1640培养基重悬，细胞计 数调整细胞浓度至IX 106/mL; (4)将准备好的带有Transwell小室的24孔板取出，下室（即 24孔板的孔）中加入500yL含有10%胎牛血清的完全培养基，以提供对细胞的趋化作用。将 上室搭在孔上，此时可见上室底面的膜刚好浸在了下室中的培养基里。观察下室的培养基 与上室底面的膜之间没有气泡即可；（5)取50yL细胞悬液加在各个孔的上室，再加入含有不 同浓度药物的无血清RPMI-1640培养基50yL，使各个孔上室药物的浓度达到实验设计浓度。 观察各孔中没有气泡；（6)将细胞放入37 °C、5C02的恒温培养箱中培养12小时，取出上室。用 棉棒轻柔擦拭小室膜的上面，将没有穿过膜的细胞擦掉；（7)将小室用PBS轻柔冲洗，洗去表 面的培养基；（8)将小室放入95%乙醇中固定10分；（9)用PBS轻柔冲洗小室表面的固定液， 再将小室放入苏木素中