性磷酸 酶)处理，以去除体系中游离的dNTPs。
[0049] (1)配制碱性磷酸酶处理反应液(SAP Mix)，如表4所示。
[0050] 表 4
[0051]
[0052] (2)使用24通道加样器，调节加样体积为2yL，将SAP Mix加入384孔PCR反应板。对 于每个碱性磷酸酶处理反应孔，反应体系总体积为7yL，其中PCR产物5yL，SAP混合液2yL (0.5U)〇
[0053] (3)将384孔板放置在兼容384孔板的PCR仪上，设定反应条件：37°C40分钟；85°C5 分钟;4 °C维持，启动PCR仪进行碱性磷酸酶处理。
[0054] 7.单碱基延伸反应
[0055] (1)在碱性磷酸酶处理结束后，进行单碱基延伸反应，反应体系总体积9yL。
[0056] (2)配制单碱基延伸反应液(EXTEND Mix)，如表5所示。
[0057] 表 5
[0058]
[0059]
[0060] (3)使用24通道加样器，调节加样体积为2yL，将EXTEND Mix对应加入384孔反应 板。对于每个反应孔，单碱基延伸反应体系包含SAP处理后PCR产物7yL及EXTEND Mix液2yL (其中各延伸反应引物混合物〇.94yL，延伸反应用酶（iPLEX酶)0.041yL，延伸反应终止子 0.2liL)〇
[00611 (4)将384孔板放置在兼容384孔板的PCR仪上，设定PCR反应条件如下：
[0062] 1.94 Γ 30秒；
[0063] ΙΙ·94Γ5秒；
[0064] III .52Γ5秒；
[0065] IV .80 Γ 5秒；
[0066] V.转到III，再4次；
[0067] VI.转到 II，再39 次；
[0068] VII .72Γ3分钟；
[0069] VIII ·4Γ维持。
[0070]启动PCR仪进行单碱基延伸反应。
[0071] 8.树脂纯化
[0072] (1)将Clean Resin树脂平铺到6mg的树脂板中；
[0073] (2)加16yL水到延伸产物的对应孔内；
[0074] (3)将干燥后的树脂倒入延伸产物板中，封膜，低速垂直旋转30分钟，使树脂与反 应物充分接触；
[0075] (4)离心使树脂沉入孔底部。
[0076] 9.芯片点样
[0077] 启动MassARRAY Nanodispenser RS1000点样仪，将树脂纯化后的延伸产物移至 384孔 SpectroCHIP(Sequenom)芯片上。
[0078] 10.质谱检测
[0079] 将点样后的 Spec troCHIP 芯片使用 MALDI-T0F (matr i x_as s i s ted 1 aser desorption/ionization-time of fligh，基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱）分析， 检测结果使用TYPER 4.0软件(sequenom)分型并输出结果。
[0080] 11.使用肿瘤易感位点基因型、中国人群中的频率和肿瘤发病率，根据可乘性风险 模型(multiplicative risk model)，分析肿瘤发病风险。具体过程包括步骤12~16。
[0081 ] 12.人群基因型频率
[0082]易感位点中国人群中的频率来源于千人（lOOOgenomes)项目。从千人提供的FTP地 址（ftp://ftp.ncbi .nih.gov/1000genomes/ftp/release/20130502/)下载个体基因型数 据，选取中国汉族人群CHB、CHS共208个样本，计算出每种基因型的比例作为人群基因型频 率。
[0083] 13.肿瘤发病率
[0084]肿瘤发病率来源于世界卫生组织下属的国际癌症研究机构公布的2012年全球肿 瘤流行病统计数据(GL0B0CAN 2012)，选取中国人群对应的肺癌发病率数据。
[0085] 14.计算单个位点的风险值
[0086] 肿瘤发病率计为Pr(D)，3种基因型分别为&，62,63，不同基因型条件下的发病率为 Pr(D|Gm)，根据全概率公式
[0087] Pr(D) =Pr(D | Gi)Pr(Gi)+Pr(D | G2)Pr(G2)+Pr(D | G3)Pr(G3) (1)
[0088] OR^OR^ORs分别对应3种基因型下的比值比（odds ratio)，其中OR!为低风险定义 为1，〇R2为杂合子基因型下的比值比，〇R3为高风险下的比值比，GWAS研究中通常使用逻辑可 加（logit-additive)模式，贝 lj0R3 = 0R22。根据 0R定义
[0089]
[0090]
[0091] 联合公式（1)计算出Pr(D|Gm)，该基因型下的风险值m
[0092]
rr \ u ) / \ ι - rr \ u ))
[0093] 15.计算多位点的风险值
[0094] 假设各肿瘤易感位点满足哈低温伯格尔平衡(HWE)，独立遗传，独立影响肿瘤风 险，则多位点下的风险
[0095] 〇Rc= Π 0Rm (5)
[0096] 16.计算肿瘤发病风险
[0097]根据0R定义，个体基因型条件下的肿瘤发病率
[0098]
[0099] 比牧该及炳竿和GLUBUUAN 2：Ui2：及仲的肿熘及炳竿，即円知迫T棒OT熘及炳风险 高于、等于或者低于正常人群。
[0100] 17.肺癌风险预测方法评估
[0101]肿瘤风险预测的评估一般有临床样本评估及模拟样本评估，后者在效果上基本等 同于前者，由于其经济有效，在疾病研究中被采用。具体过程包括步骤18~19。
[0102] 18.样本模拟
[0103] 使用肺癌风险位点基因型频率和肺癌中国人群发病率，采用生物信息学技术，随 机模拟100000个体的基因型;根据GWAS研究中的肺癌风险值0R，采用公式1~6,计算每个个 体肿瘤发病风险;模拟0-1之间的随机数，如果个体肿瘤发病风险高于随机数则患病，否则 不患病。
[0104] 19.计算 AUC
[0105] AUC(受试者工作特征曲线R0C下面积)常用于评估模型的性能。根据模拟样本基因 型和公式1~6,计算出个体肿瘤发病风险，并根据个体表型计算AUC。该步骤采用R语言的 PredictABEL包完成，结果见图1AUC结果0.693(0.686-0.7)，可以较好的表现预测效果。 [0106]以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发 明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱 离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护 范围。
【主权项】
1. 一种用于肺癌风险预测的基因检测引物组，其特征在于，包括用于进行肺癌易感 SNP的PCR扩增反应的正向引物序列SEQIDN0:l-22、反向引物序列SEQIDN0:23-44，以及 用于进行单碱基延伸反应的特异性延伸引物序列SEQ ID N0:45-66。2. -种用于肺癌风险预测的基因检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物 组。3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括用于进行PCR扩增反应的其它组 分。4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述用于进行PCR扩增反应的其它组分 包括PCR缓冲液、镁离子、dNTP混合物、DNA聚合酶和水中的一种或多种。5. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括用于对PCR产物进行处理的碱性 磷酸酶。6. 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述碱性磷酸酶是虾碱性磷酸酶。7. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括用于进行单碱基延伸反应的其它 组分。8. 根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述用于进行单碱基延伸反应的其它组 分包括延伸反应缓冲液、反应终止子和反应用酶中的一种或多种。9. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括用于对所述单碱基延伸反应的产 物进行纯化的树脂。10. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括用于接受所述纯化后的产物点 样的芯片。
【专利摘要】本发明公开了一种用于肺癌风险预测的基因检测引物组和试剂盒。本发明的引物组包括用于进行肺癌易感SNP的PCR扩增反应的正向引物序列、反向引物序列，以及用于进行单碱基延伸反应的特异性延伸引物序列。本发明的试剂盒包含上述引物组。本发明针对中国人群肺癌的易感位点，结合可乘性风险评估模型，可以有效预测肺癌发病风险。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105567822
【申请号】CN201610023226
【发明人】张青, 罗宏敏, 杨旭, 杨琳, 吴莉萍, 汪明华, 陆婧雅
【申请人】深圳瑞奥康晨生物科技有限公司
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2016年1月13日