体到每个孔中，RT摇床上解育1.5小时。抽去每个孔中的检测抗体，IX洗 液I清洗3次，每次IOmin室溫摇床震荡，每孔15化L的1 X洗液I，每次清洗要抽干净洗液，然 后加入1 X洗液II清洗3次，每次5min室溫摇床震荡，每孔15化L的1 X洗液II，每次清洗要 抽干净洗液。
[0022] Cy3-链霉亲和素的解育 离屯、切3-链霉亲和素小管，然后加入1.4ml的样品稀释液，混合均匀后再次快速离屯、。 添加8化L的切3-链霉亲和素到每个孔中，用侣锥纸包住玻片避光解育，RT摇床上解育1个小 时。抽去每个孔中的切3-链霉亲和素，1 X洗液I清洗3次，每次IOmin室溫摇床震荡，每孔 15化L的1 X洗液I，每次清洗要抽干净洗液。，然后加入1 X洗液II清洗3次，每次5min室溫 摇床震荡，每孔15化L的1 X洗液II，每次清洗要抽干净洗液。
[0023] 戀巧光检测 将固定忍片的玻片框架拆掉，小屯、不要用手接触到玻片印制抗体的一面。采用激光扫 描仪例如InnoScan 300扫描信号，采用切3或者绿色通道（激发频率=532加1)。采用QAM-CYT-I的数据分析软件来进行数据分析，分析所得数据见图3、图4、图5。
[0024] 二、多肤的活性功能鉴定实验 样本细胞因子的忍片检测 多肤与DC作用后的培养上清为样本，将受试样本10倍稀释后加入包被完好的细胞因子 检测忍片，作用30分钟后显色，置于检测仪器先对不同细胞因子显色扫描，获取发光强度 值。同时做已知阳性多肤和空白对照，并用标准品做定量对照，绘制标准曲线，根据标准曲 线计算出样本中细胞因子的量，其中与B细胞和T细胞多肤相关的因子有化-2 丫，具体检测值见图3、图4和图5。
[0025] DIL-2 分析 化-2即白细胞介素-2(inte;rleukin-2，]X-2)，又名T细胞生长因子（T cell growth factor，TCRF)。主要由活化的CD4+化I细胞产生的具有广泛生物活性的细胞因子。可促进 ThO和CTL的增殖，故为调控免疫应答的重要因子，也参与抗体反应、造血和肿瘤监视。能活 化T细胞，促进细胞因子产生；刺激NK细胞增殖，增强NK杀伤活性及产生细胞因子，诱导LAK 细胞产生;促进B细胞增殖和分泌抗体;激活巨隧细胞。比-2的主要生理作用是刺激和维持T 细胞的分化增殖。因此，多肤与DC刺激后释放IL-2的水平反应其多肤活化T细胞免疫反应的 能力，是评价T细胞多肤的重要指标。结果表明，阳性对照多肤刺激后释放IL-2的浓度为 0pg/ml，与阳性对照相比，实验筛选多肤组多肤刺激后释放IL-2为：f?1.96pg/ml(p< 0.001)，：戀5.5 pg/ml (p<0.0001)，感0.84 pg/ml(p<0.001)，其余受试多肤释放化-2的 浓度为化g/ml，参见图3。
[0026] 2)IL-4 分析 细胞介素-4(白介素-4，Interleukin-4，化-4)是II型辅助T细胞(化2细胞)分泌的细 胞因子。白细胞介素-4的生物作用，包括刺激活化B细胞和T细胞增殖、CD4巧细胞分化成II 型辅助T细胞.它也在调节体液免疫和适应性免疫中起关键作用。白细胞介素-4诱导B细胞 抗体类别转换向I姐，为B细胞生长因子-1 (B cell growth factor-l，BCGF-l)e]X-4促进 B细胞MHC n类抗原、FceRn/CD23和CD40的表达，并增强B细胞提呈抗原能力，使免疫系统对 小量抗原刺激发生免疫应答。促进巨隧细胞提呈抗原和杀伤肿瘤细胞的功能，可能与调节 MHCE类抗原和FcR表达有关。化-4与GM-CSF、比-3和LPS有协同作用。比-4可诱导外周血单 核细胞分泌G-CSF和M-CSF，增强中性粒细胞介导的吞隧、杀伤活性和ADCC作用。因此，化-4 分泌水平是评价多肤B细胞免疫反正能力的重要指标。结果表明，阳性对照多肤刺激后释放 IL-4的浓度为7.7pg/ml，与阳性对照相比，本发明实验筛选出的各样本多肤组多肤刺激后 释放比-4分别为：蛋 16.8 pg/ml(p<0.001),謬17.9 pg/ml (p<0.001)，變il6.5 pg/ml(p< 0.001)，懇15.1 pg/ml，感 13.0 pg/ml，邊濟.0 pg/ml，透統.9pg/ml。
[0027] 4) IFN-丫分析 干扰素(IFN)是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面 受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制乙肝病毒的复制，其类型分为=类，曰-(白细胞） 型、0-(成纤维细胞）型，丫-(淋己细胞）型；丫-干扰素（Interferon-丫，IFN-丫）是水溶性 二聚体细胞因子，是II型干扰素的唯一成员。最初叫巨隧细胞活化因子。IFN-T是I型辅助 T细胞(Thl细胞）的标志性的细胞因子。II型辅助T细胞(Th2细胞)释放白细胞介素-4 (IL-4)和白细胞介素-13 (化-13)。自然杀伤细胞和CD8T细胞也产生丫 -干扰素。丫-干扰素通 过迅速降解RANK-RANKL信号通路的TRAF6而抑制破骨细胞形成。多肤刺激DC后丫-干扰素释 放水平与T细胞的活化呈正相关，通过丫-干扰素的检出通常来评价多肤是否为T细胞免疫 多肤。结果表明，阳性对照多肤刺激后释放IFN- 丫的浓度为20pg/ml，与阳性对照相比，本发 明实验筛选出的多肤组多肤刺激后释放IFN-丫分别为：霉61.8 pg/ml (p<0.001)，蠻 43.6pg/ml(p<0.001)，而其余各样本未释放IFN- 丫，参见图5。
[0028] 通过W上实验表明，利用蛋白忍片检测刺激后细胞分泌化-2、Iレ4和IFN-y得到如 图3~5所示的水平，统计学分析检测结果表明，从所有肤段中获得的GGIFETRTTDTOEKLAEGN (沈9 10顯.1，即多肤样本2)和51(￥肥41^￥5?191肥155(569 10^.2，即多肤样本5)刺激0〔 后IL-2和/或IFN- 丫可大量释放，为T细胞表位多肤，而肤段GGIFETRTTDTOEKLAEGN、 TTGPGSGNAPIIAHTPAGIEGSWV(沈Q ID ^.3，即多肤样本1) 和NMRSIVRGTTSKVNCALVSPTQUSEQ ID N0.4,即多肤样本3)刺激DC后可大量释放化-4， 为B细胞表位多肤。蛋白表面抗原表位的挖掘，对研究该蛋白的免疫学功能有重要的意义， 另一方面，有效的抗原表位除去了蛋白上繁杂的非抗原决定簇，可W集中生产大量有效的 抗原表位来用作疾病的诊断和疫苗的开发，是疫苗用良好候选抗原；从蛋白上挖掘出有效 的B细胞表位，本身就是一种良好的疾病用诊断抗原，可W用于ELISA等血清学方法的建立， 其敏感性要高于蛋白抗原本身，而筛选出了表位多肤可W用的单克隆抗体的制备。本发明 实验表明SEQ ID NO. 1至SEQ ID NO.5的各多肤均为具有免疫源性功能的多肤，可用于构成 相应的重组载体或表达盒或转基因细胞或重组菌，也可在在制备诊断或预防或治疗布鲁氏 菌引起的疾病的试剂或药物中的应用。
【主权项】
1. 一种布鲁氏菌OmplO蛋白抗原表位多肽，其特征在于其氨基酸序列中含有SEQ ID N0.1或/和SEQ ID N0.2或/和SEQ ID N0.3或/和SEQ ID N0.4或/和SEQ ID N0.5。2. -种布鲁氏菌OmplO蛋白抗原表位多肽，其特征在于其氨基酸序列为SEQ ID NO. 1 或/和SEQ ID NO. 2或/和SEQ ID NO.3或/和SEQ ID NO.4或/和SEQ ID NO.5所示的序列经 过一个或/和几个氨基酸残基的取代和/或缺失形成的序列形成的多肽。3. -种布鲁氏菌OmplO蛋白抗原表位多肽，其特征在于其氨基酸序列为SEQ ID NO. 1 或/和SEQ ID NO. 2或/和SEQ ID NO.3或/和SEQ ID NO.4或/和SEQ ID NO.5所示的序列和 添加有具有布鲁氏菌免疫源性功能的衍生的多肽。4. 由SEQ ID N0.1或/和SEQ ID N0.2或/和SEQ ID N0.3或/和SEQ ID N0.4或/和SEQ ID NO.5所构成的重组载体或表达盒或转基因细胞或重组菌。5. 权利要求1或2或3所述的多肽在制备诊断或预防或治疗布鲁氏菌引起的疾病的试剂 或药物中的应用。6. -种治疗布鲁氏菌病的药物组合物，其特征在于其中有SEQ ID NO. 1或/和SEQ ID NO.2或/和SEQ ID NO.3或/和SEQ ID NO.4或/和SEQ ID NO.5。
【专利摘要】本发明公开一种布鲁氏菌Omp10蛋白抗原表位多肽及其应用。本发明的多肽是：其氨基酸序列中含有SEQ ID N0.1或/和SEQ ID N0.2或/和SEQ ID N0.3或/和SEQ ID N0.4或/和SEQ ID N0.5，或者由前述序列经过一个或/和几个氨基酸残基的取代和/或缺失形成的序列形成的多肽，也可以是前述序列和添加有具有布鲁氏菌免疫源性功能的衍生的多肽。本发明的多肽可以构成的重组载体或表达盒或转基因细胞或重组菌。而本发明所涉及的各多肽可在制备诊断或预防或治疗布鲁氏菌引起的疾病的试剂或药物中的应用。本发明筛选多肽为化学合成，经刺激DC后可释放出高浓度的IL-4，可作为目的抗原检测检测布鲁氏菌病感染的血清，或制备Omp10蛋白单克隆抗体的抗原。
【IPC分类】G01N33/68, C07K14/23, G01N33/569, A61K39/10, A61P31/04
【公开号】CN105693832
【申请号】CN201610226026
【发明人】曹小安, 周继章, 李兆才, 娄忠子, 景志忠, 付宝权, 尚佑军
【申请人】中国农业科学院兰州兽医研究所
【公开日】2016年6月22日
【申请日】2016年4月13日