专利名称：啤酒花中酮类化合物的高效液相色谱分离方法
技术领域：
本发明涉及一种将啤酒花中萚草酮、加萚草酮、合萚草酮、蛇麻酮、加蛇 麻酮、合蛇麻酮6种同系化合物单体进行分离的啤酒花中酮类化合物的高效液 相色谱分离方法。
背景技术：
萚草酮、加萚草酮、合萚草酮是一组同系物，它们是组成啤酒花中(X-酸的 主要成分，占0[-酸总量的95%以上；蛇麻酮、加蛇麻酮、合蛇麻酮是一组同系
物，它们组成啤酒花中P-酸的主要成分，占P-酸总量的95%以上，以上6种同 系化合物的分子结构分别如下<formula>formula see original document page 3</formula>
由于它们是组成啤酒花中苦味物质的主要成分，在啤酒酿造和医药领域中
具有很高的应用价值，因此分析啤酒花中a-酸和p-酸的含量以及从啤酒花及其 制品中提取、精制有效活性组分萚草酮类和蛇麻酮类化合物，成为质量评估与 控制及科学研究的关键。
对于啤酒花中a-酸和p-酸的分析方法有分光光度法、电导法、薄层色谱法、 离子交换色谱法和高效液相色谱法等。前两种常规分析方法均受a-酸和卩-酸氧 化产物的影响，不适合于测试衰老或质量差的啤酒花及其制品，不适合于有效活性组分作用机理和动力学研究。随着分析技术的迅速发展，薄层色谱法、离 子交换色谱法和高效液相色谱法广泛应用，尤其是高效液相色谱技术的成熟及
其商品化使啤酒花或制品中ct-酸和p-酸的分析方法得到进一步完善。目前用高 效液相色谱分析是采用NucleosilC18柱，314nm检测，以甲醇+水+磷酸作流动 相，0.8mL/min等度洗脱，外标法定量，在30min内，a-酸和P-酸分别被分离 成加萚草酮和萚草酮+合萚草酮，加蛇麻酮和蛇麻酮+合蛇麻酮，此法为国际方 法[单连菊，林艳，王继文，啤酒科技，2001， 5, 11-15]。美国酿造化学协会(ASBC) 和欧洲酿造协会(EBC)均推荐采用高效液相色谱法分析啤酒花及其制品中的a-酸和P酸；而中国标准GB/T20369-2006《啤酒花制品》中规定采用紫外分光光 度法和高效液相色谱法两种方法同时测定。
目前用高效液相色谱法分析a-酸和(3-酸还存在以下问题a-酸被分离成合 萚草酮峰以及萚草酮、加萚草酮合峰，卩酸被分离成合蛇麻酮峰以及蛇麻酮、 加蛇麻酮合峰，作为两对同分异构体的蛇麻酮与加蛇麻酮、萚草酮与加萚草酮 均没有得到进一步分离[赵素华，杨锦宗，分析化学，2000， 28(4),520;陆豫， 王远兴，吴芬，南昌大学学报(理工版)，2002， 26(1)， 79-81]，因此只能测定a-酸和P酸各自总的含量。图1所示即按照GB/T 20369-2006《啤酒花制品》规 定方法分析的色谱图，其中的2+3、 5+6分别是同分异构体萚草酮与加萚草酮， 蛇麻酮和加蛇麻酮的合峰，没有被分离。
随着人们对啤酒花及其制品中有效活性组分作用机理及其抗菌、抗肿瘤、 抗氧化等药理的深入研究，需要从啤酒花及其制品中提取、精制得到6种化合 物的标准样品。目前应用超临界C02萃取技术由啤酒花制备啤酒花浸膏以及初
步分离a-酸和p酸的工艺比较成熟[中国专利申请号200710018286，超临界萃 取啤酒花的同时初步分离其中的a-酸和J3酸的方法及其设备；中国专利申请号 200710180014.6，从啤酒花浸膏中分离啤酒花精油、a-酸和p酸的方法]，但是 迄今为止还没有关于如何从啤酒花浸膏或a-酸、卩酸中精制得到萚草酮、加萚 草酮、合萚草酮、蛇麻酮、加蛇麻酮、合蛇麻酮单体的报道。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种将啤酒花中 萚草酮、加律草酮、合萚草酮、蛇麻酮、加蛇麻酮、合蛇麻酮6种同系化合物 单体进行分离的啤酒花中酮类化合物的高效液相色谱分离方法。
本发明的技术解决方案是 一种啤酒花中酮类化合物的高效液相色谱分离方法，其特征是采用LU230低压四元高效液相色谱系统的反相色谱法对啤酒花 浸膏的甲醇溶液进行分离，分别收集相应馏分； 高效液相色谱条件为
色谱柱HypersilODS2， 5, 4.6x250腿； 流动相乙腈:四氢呋喃:0.1%磷酸水溶液=60:5:35; 流速1.0ml/min; 检测波长314nm; 进样量20nl; 色谱柱温室温；
啤酒花浸膏的甲醇溶液浓度是1.8~2.2mg/ml。
所述啤酒花浸膏甲醇溶液的制备是称取0.75~0.85g啤酒花浸膏于5ml离 心管中，29 3rC水浴、震荡、摇匀，用30ml甲醇将样品转移至50ml小烧杯 中，然后超声处理30 min，再转移到100ml容量瓶中，用甲醇定容，充分混匀； 取12ml混合液于50ml容量瓶中，用甲醇定容，充分混匀，用0.45pm滤膜过 滤。
本发明是用LU230低压四元高效液相色谱系统的反相色谱法，按照一定 的色谱条件对啤酒花浸膏甲醇溶液进行分离，收集相应的馏分，即得到萚草酮、 加萚草酮、合萚草酮、蛇麻酮、加蛇麻酮及合蛇麻酮6种同系化合物的单体溶 液。在此基础上经过放大、提纯即可制备这些物质的纯品，作为标准样品以满 足进一步质量控制和理论研究的需要。
图1是按照GB/T20369-2006《啤酒花制品》规定方法分析的色谱图。 图2是本发明实施例的典型色谱图。
具体实施例方式
仪器及色谱条件
大连依利特分析仪器有限公司LU230低压四元高效液相色谱仪，配备 LU230低压梯度混合器(内含在线脱气机)、P230高压恒流泵、1)￥230+紫外-可见检测器、7725i手动进样阀、EC2000色谱工作站。
色谱柱为Hypersil ODS2 5拜，4.6x250mm (I.D.XL)(大连依利特分析 仪器有限公司)。流动相A(乙腈):B(四氢呋喃):C(0.1。/。磷酸水溶液):D-60:5:35; 流速l.Oml/min; 检测器UV314nm; 色谱柱温室温。
啤酒花浸膏由新疆大学提供，甲醇(MeOH，色谱纯)、乙腈(ACN，色谱纯)、 四氢呋喃(THF，色谱纯)、85%磷酸(分析纯)购自天津市科密欧化学试剂有限公 司，经Milli-Q⑧超纯水纯化系统过滤的去离子水。
样品溶液的配制与处理
所述啤酒花浸膏甲醇溶液的制备是称取0.75~0.85g啤酒花浸膏于5ml离 心管中，29 3rC水浴、震荡、摇匀，用30ml甲醇将样品转移至50ml小烧杯 中，然后超声处理30 min，再转移到100ml容量瓶中，用甲醇定容，充分混匀； 取12ml混合液于50ml容量瓶中，用甲醇定容，充分混匀，用0.4 0.5^m膜过滤。
最佳的配置方法是称取0.839g啤酒花浸膏于5ml离心管中，3(TC水浴、 震荡、摇匀，用30ml甲醇多次将样品转移至50ml小烧杯中，然后置于超声 30min，转移到100ml容量瓶中，用甲醇定容，充分混匀。取12ml于50ml容 量瓶中，用甲醇定容，充分混匀，用0.45pm膜过滤，此时样品浓度为2mg/mL， 样品应低温避光保存。
将样品按照上述条件进样，经色谱柱分离后，在检测器出口处收集与图2 所示谱图l、 2、 3、 4、 5、 6峰相对应的馏分，经质谱仪检测，1、 2和3#峰分 别为合萚草酮、萚草酮和加萚草酮，是a-酸的主要成分；4、 5和6#峰为合蛇 麻酮、蛇麻酮和加蛇麻酮，是P-酸的主要成分。同分异构体萚草酮与加萚草酮 的分离度为1.97，蛇麻酮和加蛇麻酮的分离度为1.65，均达到了基线分离(分离 度Rs大于1.5)。为萚草酮类和蛇麻酮类化合物分析和标准样品的制备奠定了基 础。
权利要求
1. 一种啤酒花中酮类化合物的高效液相色谱分离方法，其特征是采用LU230低压四元高效液相色谱系统反相色谱法对啤酒花浸膏的甲醇溶液进行分离，分别收集相应馏分；高效液相色谱条件为色谱柱Hypersil ODS2，5μm，4.6×250mm；流动相乙腈四氢呋喃0.1％磷酸水溶液＝60∶5∶35；流速1. 0ml/min；检测波长314nm；进样量20μl；色谱柱温室温；啤酒花浸膏的甲醇溶液浓度是1.8～2.2mg/ml。
2.根据权利要求1所述的啤酒花中酮类化合物的高效液相色谱分离方法， 其特征在于所述啤酒花浸膏甲醇溶液的制备是称取0.75~0.85g啤酒花浸膏于 5ml离心管中，29 3rC水浴、震荡、摇匀，用30ml甲醇将样品转移至50ml 小烧杯中，然后超声处理25 35min，再转移到100ml容量瓶中，用甲醇定容， 充分混匀；取12ml啤酒浸膏与甲醇的混合液于50ml容量瓶中，用甲醇定容， 充分混匀，用0.45pm滤膜过滤。
全文摘要
本发明公开一种啤酒花中酮类化合物的高效液相色谱分离方法，是采用LU230低压四元高效液相色谱系统的反相色谱法对啤酒花浸膏的甲醇溶液进行分离，分别收集相应馏分；高效液相色谱条件为色谱柱Hypersil ODS2，5μm，4.6×250mm；流动相乙腈∶四氢呋喃∶0.1％磷酸水溶液＝60∶5∶35；流速1.0ml/min；检测波长314nm；进样量20μl；色谱柱温室温；啤酒花浸膏的甲醇溶液浓度是1.8～2.2mg/ml。即得到葎草酮、加葎草酮、合葎草酮、蛇麻酮、加蛇麻酮及合蛇麻酮6种同系化合物的单体溶液。在此基础上经过放大、提纯即可制备这些物质的纯品，作为标准样品以满足进一步质量控制和理论研究的需要。
文档编号B01D15/00GK101419202SQ20081022901
公开日2009年4月29日 申请日期2008年11月25日 优先权日2008年11月25日
发明者刘奎钫, 刘玉梅, 涛 唐, 孙元社, 彤 李 申请人:大连依利特分析仪器有限公司