己烯雌酚磁性分子印迹聚合物的制备方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及分离分析【技术领域】，特别公开了一种基于有机-无机杂化技术的己烯雌酚磁性分子印迹聚合物的制备方法及其应用。本发明采用共沉淀法制备四氧化三铁粒子，采用stober法制备硅烷化的四氧化三铁，采用本体聚合法制备有机-无机杂化己烯雌酚磁性分子印迹聚合物，将聚合物研磨过筛，加入洗脱剂萃取洗脱后干燥得到。本发明合成的己烯雌酚磁性分子印迹聚合物可以快速地使目标物己烯雌酚结合在其表面，并且在外加磁场作用下迅速从反应体系中分离出来，从而实现高效、高特异性地将痕量的己烯雌酚从复杂的基质中分离的目的，大大提高了样品前处理效率。
【专利说明】己烯雌酚磁性分子印迹聚合物的制备方法及其应用
[0001] (一）【技术领域】 本发明涉及分离分析【技术领域】，特别涉及一种基于有机-无机杂化技术的己烯雌酚磁 性分子印迹聚合物的制备方法及其应用。
[0002] (二）【背景技术】 由于过度使用人工合成雌激素来促进动物生长，导致雌激素类物质在环境中大量存 在。目前，在鱼及家禽中发现的雌激素残留，也在其他动物源性食品中出现，如蛋和牛奶。在 环境中存在的雌激素类物质扮演着内分泌干扰物的角色，会对动物和人的生殖系统产生极 大影响，而这种影响往往是不可逆转的。己烯雌酚作为一种广泛使用的雌激素，由于其可通 过模拟或拮抗正常的内源性激素，干扰生物体的内分泌功能，且具有潜在的致癌性，现已被 美国、欧盟等多个国家和地区明文规定禁用或限用，我国农业部也在2002年第235号公告 中明确禁止己烯雌酚及其酯用于动物源性食品中。
[0003] 目前对于雌激素残留的检测方法多为仪器分析法，如气相色谱法、高效液相色谱 法、气相色谱-质谱联用及液相色谱-质谱联用等。在对食品中的雌激素进行检测时，样品 的前处理方法主要有液液萃取和固相萃取，其中固相萃取是应用最多的方法，也是国内外 在食品以及环境样品和生物样品检测中用到的比较普遍的一种样品前处理方法。如今应用 在食品中的固相萃取材料种类虽然很多，但普遍存在特异性差的问题，往往需要增加样品 前处理步骤或对样品特别是食品样品进行进一步处理，才能达到分析检测的要求，而这往 往会导致目标物回收率的降低，并增加样品前处理的时间，影响分析效率。
[0004] (三）
【发明内容】
本发明为了弥补现有技术的不足，提供了一种制备方法简单、产品适用性强的己烯雌 酚磁性分子印迹聚合物的制备方法及其应用。
[0005] 本发明是通过如下技术方案实现的： 一种己烯雌酚磁性分子印迹聚合物的制备方法，包括如下步骤： (1) 采用共沉淀法制备四氧化三铁粒子； (2) 采用stober法制备硅烷化的四氧化三铁，将四氧化三铁粒子导入装有水和无水 乙醇的圆底烧瓶中，加入正硅酸乙酯（TE0S)，机械搅拌混匀3-5min，其中四氧化三铁粒子 的质量与正硅酸乙酯的体积比为lg:4-5ml，水于无水乙醇的体积比为1:4,然后在氮气的 保护下加入氨水，继续搅拌反应2-3h，紧接着50-60°C下水浴l_2h，用磁铁收集反应产物， 并用去离子水与无水乙醇反复冲洗反应产物直至洗液呈中性，将产物置于真空干燥箱中于 50-80°C下干燥，制得表面包覆有二氧化娃的磁性微球； (3) 采用本体聚合法制备有机-无机杂化己烯雌酚磁性分子印迹聚合物，将模板分子、 溶剂及功能单体混合，超声10_20min后放入4°C条件下静置30-60min，其中模板分子与功 能单体的摩尔比为1:15-30,模板分子的质量与溶剂的体积比为lg:30-50ml，然后加入磁 性微球、交联剂及引发剂，通入氮气保护，于50-7(TC条件下机械搅拌20-24h，进行聚合反 应，制得含有模板分子的磁性分子印迹聚合物，其中模板分子、功能单体和交联剂的摩尔比 为1:30:30,磁性微球的质量与聚合溶剂的体积比为lg:10-15ml，引发剂的质量与聚合溶 剂的体积比为lg:80-120ml ; (4)将含有模板分子的磁性分子印迹聚合物研磨过筛，然后填入索氏提取器中，加入洗 脱剂萃取洗脱，再于50-80°C下真空干燥至恒重。
[0006] 本发明制备的己烯雌酚磁性分子印迹聚合物兼具磁性分离技术与分子印迹技术 的优点，可以从复杂的样品基质中选择性的吸附目标分子己烯雌酚，排除样品中其他杂质 的感染，且能在外加磁场作用下实现磁性萃取材料与样品基质的迅速分离，从而达到快速 简便萃取分离的目的。
[0007] 本发明的更优技术方案为： 步骤（1)中，将FeCl3 · 6H20与FeS04 · 7H20溶于去离子水中，机械搅拌，通入氮气并升 温至50-60°C，一次性加入氨水，继续强力搅拌1-2 h ;其中FeCl3 · 6H20 :FeS04 · 7H20的摩 尔比为2 :1,氨水与去离子水的体积比为1 :20-40 ;反应结束后，将磁铁置于容器外侧底部， 利用外加磁场从溶液中分离出Fe304，倒掉废液，用去离子水与无水乙醇反复洗涤Fe 304至洗 液呈中性，得到均匀细腻的Fe304粒子。
[0008] 步骤（3)中，模板分子为环境雌激素己烯雌酚，功能单体为甲基丙烯酸，交联剂为 3-(三甲氧基甲硅烷基）丙基丙烯酸酯，聚合溶剂为乙腈，引发剂为偶氮二异丁腈。
[0009] 步骤（4)中，洗脱剂为体积比为9:1的甲醇与乙酸的混合物。
[0010] 本发明己烯雌酚磁性分子印迹聚合物在复杂样品前处理中的应用，包括如下步 骤： (1) 活化，去制备好的己烯雌酚磁性分子印迹聚合物加入到锥形瓶中，依次采用甲醇和 去离子水进行活化处理，利用外加磁场分离两相，倒掉废液，得到活化好的磁性分子印迹聚 合物，其中己烯雌酚磁性分子印迹聚合物的质量与甲醇的体积比为lg:30-60ml，甲醇与去 离子水的体积比为1:1 ; (2) 萃取，将样品溶液或样品萃取溶液加入到锥形瓶中，与磁性分子印迹聚合物一同置 于振荡器上震荡混合，使之充分作用，存在样品中的痕量目标物先从样品相转移至溶液相， 再被吸附到磁性分子印迹聚合物表面，其中样品的质量与溶液的体积比为lg:4-20ml ; (3) 分离，萃取完成后，在锥形瓶外壁放置一块磁铁，利用外加磁场的作用将磁性分子 印迹聚合物与溶液分离，倒掉废液； (4) 淋洗，向装有磁性分子印迹聚合物的锥形瓶中加入淋洗液，震荡混合，再次利用磁 场分离两相，倒掉废液，除去杂质，其中磁性分子印迹聚合物的质量与淋洗液的体积比为 lg:4〇-60ml ； (5) 洗脱，想锥形瓶中加入洗脱剂，洗脱磁性分子印迹聚合物，充分震荡混合，然后利 用外加磁场分离两项，收集洗脱液，将分离的洗脱液于20-50°C条件下用氮气吹干，并用 1. 0ml甲醇溶液重新溶解，经0. 45 μ m有机系滤膜过滤后注入高效液相色谱检测分析。 [0011] 所述样品的萃取溶剂为甲醇或乙醇，淋洗液为去离子水或甲醇，洗脱液为甲醇与 醋酸的混合溶液。
[0012] 本发明具有以下几个优点： (1) 本发明使用的己烯雌酚磁性分子印迹聚合物制备方法较为简单，具有很强的适用 性； (2) 采用TE0S对Fe304表面进行改，通过表面修饰调节Fe30 4粒子的生物相容性和反应 特性，从而满足其在医学、生物技术等不同方面的应用需求； (3) 采用有机与无机杂化材料结合制备的磁性分子印迹聚合物克服了单一材料易溶胀 或坍塌的缺点，具有很强的应用价值； (4) 通过分散或悬浮萃取，大大增加了吸附剂与样品溶液间的界面面积，提高了传质速 率，从而能在短时间内实现大体积样品中微量物质的分离； (5) 前处理操作过程简单快速，仅需一个外加磁场即可实现相分离，不需离心过滤等繁 琐步骤； (6) 由于不需装柱和上样，克服了常规固相萃取在处理复杂样品基质时经常遇到的堵 柱问题，且整个过程所使用的化学试剂量大为减少； (7) 引入了分子印迹技术，克服了普通固相萃取材料相对选择性较差的缺点，可对目标 分子己烯雌酚进行特异选择性吸附，极大提高了分析效率与针对性； (8) 此方法能有效地处理复杂的样品基质，如食品、生物或环境样品，这是由于待测样 品所含的杂质通常为反磁性物质，使用磁性吸附剂能有效避免杂质的干扰。
[0013] 本发明合成的己烯雌酚磁性分子印迹聚合物可以快速地使目标物己烯雌酚结合 在其表面，并且在外加磁场作用下迅速从反应体系中分离出来，从而实现高效、高特异性地 将痕量的己烯雌酚从复杂的基质中分离的目的，大大提高了样品前处理效率。基于己烯雌 酚磁性分子印迹聚合物所建立的磁性固相萃取（MSPE)分析方法高效、灵敏、准确、重复性 好，且具有较低的检测限，可满足定量分析的需要，适用于食品中己烯雌酚的残留监控。
[0014] (四）【专利附图】
【附图说明】 下面结合附图对本发明作进一步的说明。
[0015] 图1为本发明所制备的己烯雌酚磁性分子印迹聚合物应用于复杂样品前处理中 的操作步骤示意图。
[0016] 图2为本发明所制备的己烯雌酚磁性分子印迹聚合物吸附动力学曲线图。从图中 可以看出，吸附30 min之后，材料的吸附容量基本达到平衡。说明所合成的磁性材料对模板 分子具有较快的吸附动力学及传质速度，可作为磁性固相萃取材料对己烯雌酚进行富集。
[0017] 图3为本发明所制备的己烯雌酚磁性分子印迹聚合物吸附等温线图。从图中看 出，磁性分子印迹聚合物的吸附容量随己烯雌酚浓度的增加而增加，对己烯雌酚的饱和吸 附容量为726. 6 μ g/g。
[0018] 图4为本发明所制备的己烯雌酚磁性分子印迹聚合物在萃取牛奶样品中的空白 及加标样品的HPLC色谱图（加标浓度50 μ g/L)，从图中可以看出，经过前处理，牛奶样品 中的复杂基质已被基本去除，主要杂峰的出现时间在6min之前，对于待测目标物没有影 响，说明磁性分子印迹聚合物对己烯雌酚进行了选择性地分离与富集。
[0019](五）【具体实施方式】 实施例1 :根据
【发明内容】
，制备有机-无机己烯雌酚磁性分子印迹聚合物 己烯雌酚磁性分子印迹聚合物的制备过程如下： a.采用共沉淀法合成Fe304粒子。将2. 0gFeS04 · 7H20与3. 9g FeCl3 · 6H20置于锥形 瓶中，加入200mL的去离子水，机械搅拌使之溶解，随后在氮气保护下升温至60°C，一次性 加入5mL氨水，继续加热搅拌反应lh。反应结束后利用超强磁铁的外加磁场将黑色产物与 上清液分离，并用去离子水与无水乙醇反复洗涤至洗液呈中性。将合成物置于真空干燥箱 中于60°C下干燥至恒重，所得黑色产物研磨后备用。
[0020] b.采用stober法制备硅烷化的Fe304。准确称取步骤a制得的Fe30 4粒子0. 625g 倒入装有2. 5mL水和10mL无水乙醇的圆底烧瓶中，加入2. 5mLTE0S，机械搅拌混匀5min。然 后加入lmL氨水，继续搅拌反应2h，紧接着60°C水浴2h，对Fe30 4粒子进行表面改性。用磁 铁收集反应产物，并用去离子水与无水乙醇反复冲洗沉淀物直至洗液呈中性，置于真空干 燥箱中于60°C下干燥，制得表面包覆有Si0 2的磁性微球。
[0021] c.采用本体聚合法制备有机-无机杂化己烯雌酚磁性分子印迹聚合物。将26. 8mg 模板分子己烯雌酚与〇. 255mL甲基丙烯酸共同溶于lmL乙腈中，超声15min，放入4°C条件 下静置30min，以使模板分子与功能单体充分预组装；然后加入0. 15g步骤b中制得的硅烷 化的Fe304,0. 745mL3-(三甲氧基甲硅烷基）丙基丙烯酸酯及引发剂偶氮二异丁腈25mg，通 入氮气保护，于60°C条件下机械搅拌24h，进行聚合反应，制得含有模板分子的磁性分子印 迹聚合物。
[0022] d.将步骤c制备的含有模板分子的磁性分子印迹聚合物研磨过筛，然后填入索式 提取器中，并以甲醇：乙酸（9:1，v/v)为洗脱剂萃取洗脱60h，以除去模板分子，接着再用甲 醇洗脱5h以去除醋酸，60°C真空干燥至恒重，即制得己烯雌酚磁性分子印迹聚合物。
[0023] e.磁性非印迹聚合物的合成除不加入模板分子己烯雌酚外，其余步骤均与上述 磁性分子印迹聚合物相同。
[0024] 实施例2 :实施例1制备的己烯雌酚磁性分子印迹聚合物的表征 (1) 扫描电镜分析； (2) 红外光谱分析。
[0025] 实施例3 :己烯雌酚磁性分子印迹聚合物的吸附性能研究 (1)磁性印迹、非印迹聚合物对己烯雌酚的吸附动力学 为了考察本发明所制备的磁性分子印迹聚合物对模板分子的吸附速率，测试了不同吸 附时间下，50mg磁性印迹、非印迹聚合物对5mL100mg/L己烯雌酚的吸附量（Q)的变化趋势， 结果如图2所示，磁性非印迹聚合物的吸附平衡时间虽然快于印迹聚合物，但饱和吸附容 量相对较少，而且l〇min左右，磁性印迹聚合物的吸附容量基本达到平衡，说明磁性印迹聚 合物对模板分子具有较快的吸附动力学及传质速度，可作为磁性固相萃取材料对己烯雌酚 进行富集。
[0026] (2)磁性印迹、非印迹聚合物对己烯雌酚的平衡结合试验 为了评价本发明所制备的磁性分子印迹聚合物对模板分子的结合能力，测定了室温下 50 mg磁性印迹、非印迹聚合物对40-140 mg/L浓度范围内吸附容量随己烯雌酚初始浓度的 变化趋势，即吸附等温线(见图3)。从图3中可以看出，磁性印迹聚合物的吸附容量明显高 于磁性非印迹聚合物，其中印迹聚合物对己烯雌酚的饱和吸附容量为726. 6 μ g/g，非印迹 聚合物的饱和吸附容量为408. 3 μ g/g。
[0027] (3)磁性分子印迹聚合物的选择吸附性 选择己烷雌酚与双烯雌酚作为竞争物，以考察本发明制备的磁性分子印迹聚合物对己 烯雌酚的选择性。分别称取多份50mg磁性印迹、非印迹聚合物于25mL的容量瓶中，加入 5mL浓度为10mg/L己烯雌酚、双烯雌酚和己烷雌酚的乙腈混合溶液，振荡萃取lh，然后在外 加磁场作用下分离两相，在高效液相色谱仪上测定上清液中以及原始标准溶液中3种雌激 素的浓度。磁性印迹、非印迹聚合物对己烯雌酚、双烯雌酚和己烷雌酚三种化合物的分配系 数kd、选择性系数k和相对选择性系数k'如表1所示。结果表明，己烯雌酚在磁性印迹聚合 物中的分配系数为29. 70mL/g，明显高于在磁性非印迹聚合物中的分配系数3. 20mL/g。磁 性印迹聚合物对双烯雌酚和己烷雌酚的选择性系数分别为9. 40和8. 53,而这一选择性系 数在磁性非印迹材料中分别为1. 20和1. 02,磁性印迹聚合物和磁性非印迹聚合物对双烯 雌酚与己烷雌酚相对选择性系数分别为7. 83和8. 36。这说明磁性印迹聚合物对模板分子 己烯雌酚具有高度的选择性和识别能力，而对其它两种结构类似物的选择性和识别能力较 差。
[0028] 表1磁性分子印迹聚合物的选择特性
【权利要求】
1. 一种己烯雌酚磁性分子印迹聚合物的制备方法，其特征为，包括如下步骤：（1)采 用共沉淀法制备四氧化三铁粒子；（2)采用stober法制备硅烷化的四氧化三铁，将四氧化 三铁粒子导入装有水和无水乙醇的圆底烧瓶中，加入正娃酸乙酯，机械搅拌混勻3-5min， 其中四氧化三铁粒子的质量与正硅酸乙酯的体积比为lg :4-5ml，水于无水乙醇的体积比 为1:4,然后在氮气的保护下加入氨水，继续搅拌反应2-3h，紧接着50-60°C下水浴l_2h， 用磁铁收集反应产物，并用去离子水与无水乙醇反复冲洗反应产物直至洗液呈中性，将产 物置于真空干燥箱中于50-80°C下干燥，制得表面包覆有二氧化硅的磁性微球；（3)采用本 体聚合法制备有机-无机杂化己烯雌酚磁性分子印迹聚合物，将模板分子、溶剂及功能单 体混合，超声10_20min后放入4°C条件下静置30-60min，其中模板分子与功能单体的摩尔 比为1:15-30,模板分子的质量与溶剂的体积比为lg: 30-50ml，然后加入磁性微球、交联剂 及引发剂，通入氮气保护，于50-7(TC条件下机械搅拌20-24h，进行聚合反应，制得含有模 板分子的磁性分子印迹聚合物，其中模板分子、功能单体和交联剂的摩尔比为1:30:30,磁 性微球的质量与聚合溶剂的体积比为lg:l〇-15ml，引发剂的质量与聚合溶剂的体积比为 lg:80-120ml ;(4)将含有模板分子的磁性分子印迹聚合物研磨过筛，然后填入索氏提取器 中，加入洗脱剂萃取洗脱，再于50-80°C下真空干燥至恒重。
2. 根据权利要求1所述的己烯雌酚磁性分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于：步 骤（1)中，将FeCl3 · 6H20与FeS04 · 7H20溶于去离子水中，机械搅拌，通入氮气并升温至 50-60°C，一次性加入氨水，继续强力搅拌1-2 h ;其中FeCl3 ·6Η20 :FeS04 ·7Η20的摩尔比为 2 :1,氨水与去离子水的体积比为1 :20-40 ;反应结束后，将磁铁置于容器外侧底部，利用外 加磁场从溶液中分离出Fe304，倒掉废液，用去离子水与无水乙醇反复洗涤Fe 304至洗液呈中 性，得到均匀细腻的Fe304粒子。
3. 根据权利要求1所述的己烯雌酚磁性分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于：步 骤（3)中，模板分子为环境雌激素己烯雌酚，功能单体为甲基丙烯酸，交联剂为3-(三甲氧 基甲硅烷基）丙基丙烯酸酯，聚合溶剂为乙腈，引发剂为偶氮二异丁腈。
4. 根据权利要求1所述的己烯雌酚磁性分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于：步 骤（4)中，洗脱剂为体积比为9:1的甲醇与乙酸的混合物。
5. 根据权利要求1所述的己烯雌酚磁性分子印迹聚合物在复杂样品前处理中的应用。
6. 根据权利要求5所述的己烯雌酚磁性分子印迹聚合物在复杂样品前处理中的应用， 其特征为，包括如下步骤：（1)活化，去制备好的己烯雌酚磁性分子印迹聚合物加入到锥形 瓶中，依次采用甲醇和去离子水进行活化处理，利用外加磁场分离两相，倒掉废液，得到活 化好的磁性分子印迹聚合物，其中己烯雌酚磁性分子印迹聚合物的质量与甲醇的体积比 为lg:30-60ml，甲醇与去离子水的体积比为1:1 ;(2)萃取，将样品溶液或样品萃取溶液加 入到锥形瓶中，与磁性分子印迹聚合物一同置于振荡器上震荡混合，使之充分作用，存在样 品中的痕量目标物先从样品相转移至溶液相，再被吸附到磁性分子印迹聚合物表面，其中 样品的质量与溶液的体积比为lg:4-20ml ;(3)分离，萃取完成后，在锥形瓶外壁放置一块 磁铁，利用外加磁场的作用将磁性分子印迹聚合物与溶液分离，倒掉废液；（4)淋洗，向装 有磁性分子印迹聚合物的锥形瓶中加入淋洗液，震荡混合，再次利用磁场分离两相，倒掉废 液，除去杂质，其中磁性分子印迹聚合物的质量与淋洗液的体积比为lg:40-60ml ;(5)洗 脱，想锥形瓶中加入洗脱剂，洗脱磁性分子印迹聚合物，充分震荡混合，然后利用外加磁场 分离两项，收集洗脱液，将分离的洗脱液于20-50°C条件下用氮气吹干，并用1.0ml甲醇溶 液重新溶解，经〇. 45 μ m有机系滤膜过滤后注入高效液相色谱检测分析。
7.根据权利要求6所述的己烯雌酚磁性分子印迹聚合物在复杂样品前处理中的应用， 其特征在于：所述样品的萃取溶剂为甲醇或乙醇，淋洗液为去离子水或甲醇，洗脱液为甲醇 与乙酸的混合溶液。
【文档编号】B01J20/26GK104193875SQ201410290593
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年6月25日 优先权日:2014年6月25日
【发明者】何金兴, 李迎秋, 李龙飞, 崔一笑 申请人:齐鲁工业大学