专利名称：一种植物抗逆性相关蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域中一种植物抗逆性相关蛋白及其编码基因与应用，特别涉及利用该基因增强植物抗逆性的方法。
背景技术：
粮食问题是当今世界所面临的几大难题之一。通过提高单产或扩大种植面积、增加农业投入改造中低产田等途径来增加粮食产量都会碰到需要克服逆境限制或减轻逆境危害的问题。因此，认识植物对逆境的反应机制，提高植物的抗逆性，已成为农业进一步增产的重要基础研究，倍受世界各国政府和科学家的关注，也是当前生命科学研究的热点。
限制植物生长发育的逆境主要有两类生物逆境和非生物逆境，其中生物逆境主要是病虫害，非生物逆境主要是干旱。随着人类的经济发展、人口膨胀以及生物种群的破坏，植物病虫害和水资源短缺现象日趋严重，这些因素严重地影响了农业生产和生态环境，已成为全球关注的问题，因此寻求植物特别是农作物抗病、抗旱途径是十分必要的。提高作物的抗旱抗病性，除了利用传统的育种方法，目前，应用基因工程育种已经成为科技工作者所关注的领域之一。
拟南芥是一种典型的模式植物，广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究。拟南芥的大多数基因在其它植物中都能找到，有关拟南芥的任何发现都能应用于其它植物研究。因此，对拟南芥抗旱抗病性分子生物学机制的研究将极大地有助于找到提高农作物抗旱抗病性，增加产量的方法。
拟南芥共有约1.3亿个碱基对，2.9万个基因。目前大部分基因的功能还不清楚，利用突变技术研究基因功能已成为一种有效的方法。通过对突变体的研究，获知了一些抗旱抗病基因的功能，如DREB，CBF，ABRE，RD22，MYC和COR47能提高植物对干旱的抗性，PR1，FDA，CAT3和GST可提高植物的抗病性，目前，还未找到有效的抗旱抗病基因，面对日益严重的作物干旱和病害问题，寻找新的抗旱抗病基因并阐明其功能具有重要的理论及实践意义。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种植物抗逆性相关蛋白及其编码基因。
本发明所提供的植物抗逆性相关蛋白，名称为ABO1(ABA overly-sensitivel)，其来源于哥伦比亚生态型拟南芥，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质
1)序列表中的SEQ ID №2；2)将序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且与植物抗逆性相关的蛋白质。
其中，序列表中的序列2由1319个氨基酸残基组成。
上述植物抗逆性相关蛋白编码基因也属于本发明的保护范围。它包括上述植物抗逆性相关蛋白的基因组基因和cDNA基因。
上述植物抗逆性相关蛋白的基因组基因可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
其中，序列表中的SEQ ID №1由5520个碱基组成，含有5个外显子和4个内含子。
上述植物抗逆性相关蛋白的cDNA基因可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №3的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
上述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。
其中，序列表中的SEQ ID №3由3960个碱基组成，其编码序列为自5’端第1到第3960位碱基。
含有本发明基因的表达载体、细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。
本发明的第二个目的是提供一种利用该基因增强植物抗逆性的方法。
本发明所提供的增强植物抗逆性的方法，是抑制植物中的上述植物抗逆性相关蛋白编码基因的表达。
抑制植物中的ABO1基因的表达可通过多种方法实现，如植物病毒载体介导基因沉默的方法，反义核酸技术沉默基因的方法，siRNA介导的基因沉默方法等。本发明抑制基因表达的方法并不限于上述几种方法，只要能抑制ABO1基因表达均可。
利用任何一种植物基因敲除技术，将此基因敲除(或沉默)后，植物表现为抗旱、抗病、生育期延迟等特点；利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的ABO1基因转入植物中，植物表现出旱敏感、不抗病，而将此基因敲除(或沉默)后，植物则表现为抗旱、抗病、生育期延迟等特点。
本发明的ABO1基因或其反义核酸在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素，卡那霉素等)。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草或苜宿等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以植物苗期叶片失水程度、叶片抗病程度来筛选转化植株。携带有本发明的ABO1基因或其反义核酸的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物经组织培育成植株。
ABO1基因具有“一因多效”特点与抗旱、抗病、抗氧化胁迫相关；可调控根系生长、生育期、气孔发育、花器官发育等。因此，利用基因工程技术在植物体内对ABO1基因进行任何修饰，就能获得多重效应，有利于应用基因工程育种，培育出抗逆性(抗旱和抗病)增强的作物品种。
图1为拟南芥abo1，转ABO1基因植株与野生型植株根系发育和生育期情况图2为拟南芥abo1，转ABO1基因植株与野生型植株气孔对ABA反应情况图3为拟南芥abo1，转ABO1基因植株与野生型植株气孔发育情况比较图4为拟南芥abo1，转ABO1基因植株与野生型植株花器官发育情况图5a为拟南芥abo1，转ABO1基因植株与野生型植株抗旱情况图5b为拟南芥abo1，转ABO1基因植株与野生型植株抗氧化胁迫情况图5c为拟南芥abo1，转ABO1基因植株与野生型植株抗病情况图6a-图6b为RNA印迹杂交方法检测ABO1在植株中对抗逆性基因表达的影响具体实施方式
下述实施例中的实验方法如无特别说明，均为常规方法。
实施例1、ABO1及其编码基因的获得引物15’CTGCTTCCTGGATCTGTAGCTGC 3’引物25’CCTTCCTCTACCGTTTTGTATCT 3’以野生型哥伦比亚生态型拟南芥的幼苗各100-200mg为材料，用Trizol分别提取根和茎干总RNA，经1％琼脂糖电泳检测RNA的完整性。ss cDNA的合成按照SuperScriptTMII RNase H-Reverse Transcriptase的方法，合成单链(ss)cDNA。将合成的单链cDNA稀释10倍，作为以下PCR反应的模板20μl体系，内含10×PCR缓冲液2μl，2.5mM dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)混合物1.6μl，5μM的引物1和引物2各1.0μl，Taq酶(15U/μl)0.1μl。在PE 9700仪上扩增94℃预变性3min；94℃ 30 sec，55℃ 30 sec，72℃ 1min 30 sec，共计35个循环；72℃延伸4min，将获得的PCR产物，作1％琼脂糖凝胶电泳。将目的片段连接于T-载体，进行测序鉴定，结果表明PCR得到的cDNA片段具有序列表中序列3的DNA序列，为ABO1的cDNA基因，由3960个碱基组成，其编码序列为自5’端第1到第3960位碱基，编码具有序列表中序列2的氨基酸残基序列的蛋白质。将该cDNA基因与拟南芥基因组数据库进行比较，获得ABO1的基因组基因，它具有序列表中序列1的DNA序列，由5520个碱基组成，含有5个外显子和4个内含子。
实施例2、培育抗逆性增强的拟南芥1、ABO1基因被敲除的纯合突变体abo1的获得根据ABO1基因序列中的特异性片段，设计引物RNAi-F5’CTGCTTCCTGGATCTGTAGCTGC 3’和RNAi-R5’CCTTCCTCTACCGTTTTGTATCT 3’，以哥伦比亚生态型拟南芥基因组DNA为模板，进行PCR扩增，得到长度约为350bp的目的片段，利用gateway系统(入门载体构建转化系统，购自INVITROGEN公司)将该350bp目的片段整合到质粒pJawoh-8(购自INVITROGEN公司)中，形成反向重复序列，经测序检测整合片段和插入方向正确，转化农杆菌(筛选标记为卡那霉素、氨苄青霉素、庆大霉素)，利用农杆菌侵染方法转化拟南芥，对得到的F1代植株用除草剂草丁磷(basta，购自INVITROGEN公司)筛选转化苗，分离纯化。对经草丁磷筛选无分离性状现象的株系Trizol提取总RNA，琼脂糖电泳后转尼龙膜，进行Northern-blot检测。其中，所用的探针为以野生型拟南芥组DNA为模板，利用引物1和引物2进行PCR扩增得到的DNA片段，其中20μl PCR反应体系内含10×PCR缓冲液2μl，2.5mM dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)混合物1.6μl，5μM的引物1和引物2各1.0μl，Taq酶(15U/μl)0.1μl。在PE 9700仪上扩增94℃预变性3min；94℃ 30 sec，55℃ 30 sec，72℃ 1min 30 sec，共计35个循环；72℃延伸4min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测得到3960bp的DNA片段。该3960bp的DNA片段经P32标记后与总RNA杂交，结果未得到杂交条带，证明ABO1基因表达的RNA已被降解，得到纯合突变体abo1。
2、转ABO1基因拟南芥植株的获得根据拟南芥的ABO1基因cDNA序列(序列3)，在起始密码子ATG前和终止密码子后分别设计以下引物
引物15’CTGCTTCCTGGATCTGTAGCTGC 3’引物25’CCTTCCTCTACCGTTTTGTATCT 3’以野生型哥伦比亚生态型拟南芥的幼苗各100-200mg为材料，用Trizol分别提取根和茎干总RNA，经1％琼脂糖电泳检测RNA的完整性。单链(ss)cDNA的合成按照SuperScriptTMII RNase H-Reverse Transcriptase的方法，合成sscDNA。将合成的单链cDNA稀释10倍，作为以下PCR反应的模板20μl体系，内含10×PCR缓冲液2μl，2.5mM dNTP(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)混合物1.6μl，5μM的引物1和引物2各1.0μl，Taq酶(15U/μl)0.1μl。在PE 9700仪上扩增94℃预变性3min；94℃ 30 sec，55℃ 30 sec，72℃ 1min 30 sec，共计35个循环；72℃延伸4min。将获得的PCR产物，作1％琼脂糖凝胶电泳。将目的片段连接于T-载体pMD 18-T(TaKaRa公司)进行测序鉴定，获得序列正确的ABO1的cDNA序列，将该重组克隆载体命名为pT-ABO1(含有SacI和Sse8387I识别位点)。利用限制性内切酶SacI和Sse8387I(购自TaKaRa公司)将ABO1的cDNA片段切下，利用T4 DNA连接酶将其连接入pCAMBIA1300表达载体(购自TaKaRa公司)的SacI和PstI(Sse8387I和PstI有共同的粘性末端)识别位点间，将得到的连接产物转化大肠杆菌DH5α，经克隆筛选和酶切鉴定，得到含有ABO1的cDNA的重组表达质粒pCAMBIA1300-ABO1。将重组表达的质粒pCAMBIA1300-ABO1转化农杆菌GV3101，质粒PCR及酶切鉴定后，阳性菌株用于转化植物。
将阳性农杆菌菌株接入YEB培养基，28℃培养5～6小时，OD600约0.8～1.0时，5000g，离心15分钟集菌，用1/2MS+5％蔗糖重悬细胞，加入质量百分含量为0.02％的表面活性剂sillwit(购自TaKaRa公司)用于转化植物。转化拟南芥采用花蕾直接浸染法，转化后黑暗低温(16摄氏度)培养24小时后转入正常培养条件下生长、收获种子、利用潮霉素筛选转基因植物苗，得到100多株转ABO1基因植株。
3、abo1、野生型植株和转ABO1基因植株的抗逆性比较将在土壤中生长2周的abo1、野生型植株和转ABO1基因植株停止浇水10-14天，观察比较植株存活率及叶片萎焉情况以确定其抗旱性。
选取在土壤中生长4-5周的abo1、野生型植株和转ABO1基因植株的莲座叶，接种丁香假单孢菌(Pseudomonas syringae)DC3000，保湿1天，2天后观察比较叶片菌斑大小情况以确定其抗病性。
将abo1、野生型植株和转ABO1基因植株的种子播种在普通(MS)培养基上，4℃下春化2-3天后在22℃、16小时光照8小时黑暗条件下培养5-6天，然后转移到含有不同浓度的ABA(0、0.5、1、10μM)的培养基上在22℃、16小时光照8小时黑暗条件下培养7-10天，观察比较植株根系及整株生长情况以确定对ABA的抗性。
将abo1、野生型植株和转ABO1基因植株的种子播种在普通(MS)培养基上，4℃下春化2-3天后在22℃、16小时光照8小时黑暗条件下培养5-6天，然后转移到含有不同浓度的过氧化氢(1，3，5，7，10mM)的培养基上在22℃、16小时光照8小时黑暗条件下培养7-10天，观察比较植株根系及整株生长情况以确定对氧化胁迫的抗性。
与野生型(WT)相比，ABO1基因被敲除的突变体abo1植株根系生长慢，生育期延迟14天(图1)，转ABO1基因植株根系生长快，生育期提前10天；abo1植株叶片气孔对ABA反应敏感，关闭快，相对而言，水分蒸腾减弱，有利于植物抗旱(图2)，转ABO1基因植株叶片气孔ABA反应不敏感，关闭慢，相对而言，水分蒸腾加快，不利于植物抗旱；abo1植株叶片气孔对称性发育不良，相对而言，气孔数量减少一半(图3)，转ABO1基因植株叶片气孔发育正常，数量增加1倍；abo1植株花器官发育不良，花瓣不伸出(图4)，转ABO1基因植株花器官发育正常，花瓣正常伸出；abo1植株表现出抗旱、抗氧化胁迫和抗病(图5a-图5c)，转ABO1基因植株耐旱性低、抗氧化胁迫能力低、抗病性差。
实施例3、检测abo1植株中抗逆基因表达情况选取在普通(MS)培养基中生长2周的abo1、野生型植株分别进行以下处理ABA(脱落酸)处理用浓度为100微摩尔每升的ABA(脱落酸)溶液分别浸泡整个植株9、12、16、24小时；NaCl(氯化钠)处理用浓度为200毫摩尔每升的NaCl(氯化钠)溶液分别浸泡整个植株3、5、12、16、24小时；H2O2(过氧化氢)处理用浓度为10毫摩尔每升的H2O2(过氧化氢)溶液分别浸泡整个植株9、12、16、24、48小时；SA(水杨酸)处理用浓度为500微摩尔每升的SA(水杨酸)溶液分别浸泡整个植株24、48小时；JA(茉莉酸)处理用浓度为100微摩尔每升的JA(茉莉酸)溶液分别浸泡整个植株24、48小时；冷处理将植株分别置于-10℃3、5、24小时；分别提取上述处理的植株RNA，利用RNA印迹杂交技术分析RD22(所用的探针是以植株基因组DNA为模板，利用引物5’-G GAA CCG CCG TGA ACG TTG G-3’和5’-CTCAGT GGA AAC AGC CCT GAC GTG-3’进行PCR得到的DNA片段)，MYC(所用的探针是以植株基因组DNA为模板，利用引物5’-GGT GTT GCT CCG TCG GAT GAC-3’和5’-ACC ACC GAC ATA CTC GCG TG-3’进行PCR得到的DNA片段)，COR47(所用的探针是以植株基因组DNA为模板，利用引物5’-GAA GCT CCC AGG ACA CCA CGA C-3’和5-CAG CGA ATG TCC CAC TCC CAC-3’进行PCR得到的DNA片段)，CAT3(所用的探针是以植株基因组DNA为模板，利用引物5’-CAC TCC GGT GTT CTT CAT CCG TG-3’和5’-CAT GGT GAT TGT TGT GGT GAG CAC-3’进行PCR得到的DNA片段)和GST(所用的探针是以植株基因组DNA为模板，利用引物5’-CACGGAGTTCCCATGTCCACCG-3’和5’-CCCAAGCAGGCCTGGCAGAG-3’进行PCR得到的DNA片段)等胁迫诱导基因分别在abo1、野生型植株中的表达情况，以确定其对相应胁迫的抗性大小。
结果如图6a所示，与野生型植株相比，abo1植株的RD22在H2O2处理下，表达量明显增加；abo1植株的MYC在NaCl处理下，表达量明显增加；植株表现出抗旱和抗氧化胁迫。图6a中，上方的9，12，16和24表示处理时间；Control表示未经处理的野生型植株和abo1植株；下方的1-24表示泳道，1-2泳道为Control，3-10泳道为ABA处理，11-16泳道为NaCl处理，17-24泳道为H2O2处理，每种处理中的奇数泳道为野生型植株，偶数泳道为abo1植株。
与野生型植株相比，abo1植株的CAT3和GST在NaCl，冷(cold)，SA(水杨酸)，JA(茉莉酸)，H2O2的处理下，表达量明显增加，植株表现出抗旱、抗病和抗氧化胁迫(如图6b所示)。图6b中，上方的3，5，24和48表示处理时间；Control表示未经处理的野生型植株和abo1植株；下方的1-24表示泳道，1-2泳道为Control，3-6泳道为NaCl处理，7-12泳道为冷处理(cold)，13-16泳道为SA处理，17-20泳道为JA处理，21-24泳道为H2O2处理，每种处理中的奇数泳道为野生型植株，偶数泳道为abo1植株。
序列表<160>3<210>1<211>5520<212>DNA<213>拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)<400>1gtgtaacgga catctcgtca ttttttactt gttgtggtta aaggttcctt ttgaatcgga 60atgtaagcat tagcaatgaa caaaaatgta gcagatgcac cttaatctca tagtacagta 120acaataggaa agatacaaaa cggtagagga aggttttgat gtttaaaaag cacaagctta 180ttcagtcaaa aacagatgta gagattttca tgggcttatg aagaccttaa gcatccagct 240aaaggcatct gaatctcgtg ctgtggatct cgtcttctga gcgtaacgtt caaagcaata 300aacttcttca tctacgctct cgctggacac tgtatcgtgt gctagctcta cagctgctac 360ttgggagacc tggaaattct ctgcagtctg ttgcaacttc tgtgcagact ccatttcacc 420aagtgttacc agacatatca acaacgactt cagctctcgc tttcctccat cggtcatacg 480catacctttc aaatgatcaa caagagccat ctcctcaccc gcactgcatt tttaccccaa 540attcatttac atttttgctc atcattggta cctatcaatt tgcataagag atgtctatat 600atatacctgc cagcacggat tttcccactc tttctctggc gcctcaaatc tcttgccctg 660ctagtagcgt tgcttgagct gactgaagca gcagaacctc tccttgtcct ggaataatag 720catagaggaa acaagaactt gtaagttaag gtccaaacta gttagtaact gtttccctat 780ttaacccaca aaacaactac attatagaga aattgattcc tgagaaaagt cttcattctc 840tacccaatgc cctacaactt ttacgttacg acttgtcaac acgcttgtcc cttcaaatgc 900ttaatcaaaa ccaaagaaaa tgcagaacgt gcctaaatct ccttttgaat cgtcagctct 960caactagcag gctaaacaat catgcactaa agtcccaccc ggaaacttat cactttacca1020atacaaaatt atatatgttg gaatgttcat gcatataatc agatgctggt taatcgagga1080ggagacaatc agaaaacatg ttgaagtcat gagacaaaaa aaacgaacat gagctcctgt1140ttctaaaaac gatcaatacc taattcagct ctgttttaga ttgaaatctg taagatcagc1200tgagaaaaat tccacataaa taaagactgc gagagtaaga caaatgcaag gatgtacccc1260aaagtatagg cgctcattcc actcaggttg ctacttgctt ctgaagctgt gtcatcgtca1320
agatcaacaa cagatcgttc ctcggatttg agctttgctg caagcaataa tcgtctctgc1380cggacagcta gatagcgagt caaatatttt cctacctttt ctattgattc tttgaattca1440cttactagac cactagcaca ctccaaagca gaacttttca ccactgagat tctatcatct1500gctgtatgca aaaatgcaac ccttaaagcc tcttcccatt ccctcgcatt gataagcaaa1560ctaattccac cgcttatatc gctgcaatac tcaagcgcta tttttgctgc ttccgctggt1620ttcccaagag cattgacctc ttcacagagt tcatatgcca atttcaagat ctcatcttta1680cctaatttca ttagcgcccc cactcggagt accccactcc agtcaccaca ttcacgatat1740gcctttgaag ccttttccag tttacagcaa cataggtatg tagtagcagc atcctcaaaa1800cgtttttcat caatgaggtg atctgcccaa gcctctagaa caactagttt cttctcagga1860tcagtaatta gcaggaggcc cagagggaaa agttgagggt ttttctttat taagttcatg1920caatcaggaa agtagccaac ccctgctgat acaatgttcc taagagcact atcaaaacgc1980tgcaatttaa tgtcaatctt gaaatgcatc agggattcgg gcattttttc cagctcctgg2040agataaggta aaaattcttt tggatcacgc tgggaattga gtgccacaat agctgcaagg2100ttcagatcat aaagacctaa ggcagcttca aagacagcct cagaatccaa taaccacaga2160agatgtttca aggcttcttc tgcagatgga caagactttt tccttatatc atcagaagag2220tttagcaact ccatttcacg aacagatttt atcctcaaaa gagattcttc gatagctggt2280ggatcacttc gggcaagagt ggtcaaaata cagagttccc ttgatggact ttctgggata2340tgttcttcaa gggccttcct aattgcctgt agaactgatg atactttgtt actgcaacta2400tctttcacac gaaaaacctc gtctcccttt ttggaaaagg aaaacttttt gtacagcgtt2460tctgtaacat cttcattctt catggcacaa acaaattctg taacatggtt caaattgttt2520acttgctcaa caaatgctac ggctgactgt agaaatgcct gccacccata tagatccacg2580ataacattaa agtcgattct atgacgcctt accaagttaa atgcatcttt gaaccgttgc2640tgagctaacg cattcgtaat ggaagagagg accagctttc tgggatatat gcattcgaga2700ttcccccgca tagtttgtaa tatcacagca gcttcatctc cattgaggac tcctatcact2760tttgcacctc tttcccaaat attaacatag ctcatatttt cctcgtctcg ccttctacca2820tcaataacaa agaacacatt tccaagtgcc acatctccat tcagtacatc cttggtatcg2880acaataaaga gaaaatcctg tttggtcaaa ataatcagat gggtaactac ttcattggcc2940aactctgaat aaaatgagaa actgctacag ttattacata ggttcttccc gttgatggac3000agtctaccca tatcatcaag cccacatatc aagggtttat gcaccccact agcatcaacc3060tgtgccaccc tcacccaagg acaagtcgat ggaaaacata cactatcatc actactacga3120gtttccataa tttctgacct tgacgcatat ccaagcactt tcccaccctc aaactccaca3180aaggctgaat cacgcttact aggattccag gcaagagcca ggaccggtga ttcgagaagt3240
gtctggaaag taatgctagc cttaaagcca gagcaagtca cttgatcagg aacatgatcc3300tcatgacaga ctacttcaac ttcttgtaaa taagaaccat gaagctctgt gtcataccct3360cccgaagaga gacacttgtt gtggctagaa ccataagcgg agacacacag aagtgagtgg3420acatccaacc atagaagatg tacaaaagag cccagtgctg ttttacagtc tgaaatttcc3480acactgaagt ctttgccttc gagatcttcc caagtattag gtgcagggaa ctcaacaaaa3540gacaggtttc catctgacaa aaacacagcc agacaattct tagaattcct tgagtaatat3600gctatatctc tgacagcaga agaaaaacta aggctgaaca aatacatagg aggtggcatc3660aaggacaaag atagtggtgt cacgagtatc ttggagttat ctatgacaaa ggctgttgag3720tcctccatga ccgctgttac ccacataaag tggcgaacag acacctgccc tgacagagtc3780caacatatta actgcagtgg ctttgttgga tcccacatga ctgttacccc agcttccctt3840ggatacctaa tctcctgttt caggtaccag tggttgttgc taaagaacca caccctaatg3900gcatcatatg ttttacaact aacaacccct gcaagaagat ctgatgcaga attccatttc3960agattttcac atgattccgt agcatcttct ggttcaccaa ttctaaacga gcttctctca4020agtccattcc tctcaaagaa agcaatcgat ggactgctat catctgactt cctcttataa4080acagctgcga ttttagcacc actcggcatc cattcaagaa tcccctgcgt aaattctttt4140gtttctgaag aagactgcaa agcaccggaa tcactttccc atatcttaat cttcttagac4200atacaaccag actcataaac ctcacccata gtcgcaaaat actttccatc acccctccag4260gaaatggaaa tacccccaca atttacagac aaatcattcg tttcacctaa aacagtattt4320aattcagatg gttagcaaat aaacaaaagc tgttcacgat aagtttcaac tcaaacccat4380aaatttaacc cttatgcagt caatatgaca agaaggtaag gggtccttac gtacgtaacc4440accttcagga acctctccaa gcgccttctc gtacatcaaa gcccaatcat aagtcattac4500aagcaactgc ccaagaccag taatcaatcc aagtagatct ccagtcggat taggcgagat4560acacttgaca cctccttcta tatttccaac tagctcagtc acatcactct ccacattatg4620cactagcaaa agcccatgag aagtcccaat taatagagac tccttctccg cgagataatc4680gaaagccgtg atgaaatccc caggctcaat atcaatactg cagacctcca caggcatagc4740actctttgcc ccagcgcttt cattctgcca caagaaatac ataaacataa agagaaagac4800tttcgattta aacagaccct actcgctaag ttcacttgca agttcatcca caagaaactt4860gaatcaaaag caaaataaaa agaaaaatcc atctttagac caaagtcccc aacttttttc4920tcactcgttt ccttattaag cagaaacagg attaaccaag gaggaaacga attctctcac4980agaaagcaat tcacttactt ggaaggaaga gagctgaagg gcgtaaacga aattagcaga5040agatgcgaaa aataagcgac tttggtcgat gtcataagct gcgaactgta caacttcttc5100agtcgaatgc aattggatgt tctgaggaac ctccgagaaa agcttcaaat ttttcatttt5160
cgaagaagta agaatcagta caacatcaac gaactttgca gctacagatc caggaagcag5220atttaaaccc cagaaatcac tgatataata atatttaggg tttaacctaa aacacgcctt5280cttctctgtt tttcttttct tctctgtttc ctctctttcg ttttgctata aacttgaaaa5340actgacccgg tttattttac cacaccggtt atcttggttt ataccggttt agtttgtaag5400aaatataata ttattatccg gccactttct tcagagatca gttttctatg cctttccttg5460ctgattctct cactagtgag gaaaagcatc atcatgcatt ccatcaaatt ggttttgttg5520<210>2<211>1319<21 2>PRT<213>拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)<400>2Met Lys Asn Leu Lys Leu Phe Ser Glu Val Pro Gln Asn Ile Gln Leu1 5 10 15His Ser Thr Glu Glu Val Val Gln Phe Ala Ala Tyr Asp Ile Asp Gln20 25 30Ser Arg Leu Phe Phe Ala Ser Ser Ala Asn Phe Val Tyr Ala Leu Gln35 40 45Leu Ser Ser Phe Gln Asn Glu Ser Ala Gly Ala Lys Ser Ala Met Pro50 55 60Val Glu Val Cys Ser Ile Asp Ile Glu Pro Gly Asp Phe Ile Thr Ala65 70 75 80Phe Asp Tyr Leu Ala Glu Lys Glu Ser Leu Leu Ile Gly Thr Ser His85 90 95Gly Leu Leu Leu Val His Asn Val Glu Ser Asp Val Thr Glu Leu Val100 105 110Gly Asn Ile Glu Gly Gly Val Lys Cys Ile Ser Pro Asn Pro Thr Gly115 120 125Asp Leu Leu Gly Leu Ile Thr Gly Leu Gly Gln Leu Leu Val Met Thr130 135 140Tyr Asp Trp Ala Leu Met Tyr Glu Lys Ala Leu Gly Glu Val Pro Glu
145 150 155 160Gly Gly Tyr Val Arg Glu Thr Asn Asp Leu Ser Val Asn Cys Gly Gly165 170 175Ile Ser Ile Ser Trp Arg Gly Asp Gly Lys Tyr Phe Ala Thr Met Glyl80 185 190Glu Val Tyr Glu Ser Gly Cys Met Ser Lys Lys Ile Lys Ile Trp Glu195 200 205Ser Asp Ser Gly Ala Leu Gln Ser Ser Ser Glu Thr Lys Glu Phe Thr210 215 220Gln Gly Ile Leu Glu Trp Met Pro Ser Gly Ala Lys Ile Ala Ala Val225 230 235 240Tyr Lys Arg Lys Ser Asp Asp Ser Ser Pro Ser Ile Ala Phe Phe Glu245 250 255Arg Asn Gly Leu Glu Arg Ser Ser Phe Arg Ile Gly Glu Pro Glu Asp260 265 270Ala Thr Glu Ser Cys Glu Asn Leu Lys Trp Asn Ser Ala Ser Asp Leu275 280 285Leu Ala Gly Val Val Ser Cys Lys Thr Tyr Asp Ala Ile Arg Val Trp290 295 300Phe Phe Ser Asn Asn His Trp Tyr Leu Lys Gln Glu Ile Arg Tyr Pro305 310 315 320Arg Glu Ala Gly Val Thr Val Met Trp Asp Pro Thr Lys Pro Leu Gln325 330 335Leu Ile Cys Trp Thr Leu Ser Gly Gln Val Ser Val Arg His Phe Met340 345 350Trp Val Thr Ala Val Met Glu Asp Ser Thr Ala Phe Val Ile Asp Asn355 360 365Ser Lys Ile Leu Val Thr Pro Leu Ser Leu Ser Leu Met Pro Pro Pro370 375 380Met Tyr Leu Phe Ser Leu Ser Phe Ser Ser Ala Val Arg Asp Ile Ala385 390 395 400Tyr Tyr Ser Arg Asn Ser Lys Asn Cys Leu Ala Val Phe Leu Ser Asp
405 410 415Gly Asn Leu Ser Phe Val Glu Phe Pro Ala Pro Asn Thr Trp Glu Asp420 425 430Leu Glu Gly Lys Asp Phe Ser Val Glu Ile Ser Asp Cys Lys Thr Ala435 440 445Leu Gly Ser Phe Val His Leu Leu Trp Leu Asp Val His Ser Leu Leu450 455 460Cys Val Ser Ala Tyr Gly Ser Ser His Asn Lys Cys Leu Ser Ser Gly465 470 475 480Gly Tyr Asp Thr Glu Leu His Gly Ser Tyr Leu Gln Glu Val Glu Val485 490 495Val Cys His Glu Asp His Val Pro Asp Gln Val Thr Cys Ser Gly Phe500 505 510Lys Ala Ser Ile Thr Phe Gln Thr Leu Leu Glu Ser Pro Val Leu Ala515 520 525Leu Ala Trp Asn Pro Ser Lys Arg Asp Ser Ala Phe Val Glu Phe Glu530 535 540Gly Gly Lys Val Leu Gly Tyr Ala Ser Arg Ser Glu Ile Met Glu Thr545 550 555 560Arg Ser Ser Asp Asp Ser Val Cys Phe Pro Ser Thr Cys Pro Trp Val565 570 575Arg Val Ala Gln Val Asp Ala Ser Gly Val His Lys Pro Leu Ile Cys580 585 590Gly Leu Asp Asp Met Gly Arg Leu Ser Ile Asn Gly Lys Asn Leu Cys595 600 605Asn Asn Cys Ser Ser Phe Ser Phe Tyr Ser Glu Leu Ala Asn Glu Val610 615 620Val Thr His Leu Ile Ile Leu Thr Lys Gln Asp Phe Leu Phe Ile Val625 630 635 640Asp Thr Lys Asp Val Leu Asn Gly Asp Val Ala Leu Gly Asn Val Phe645 650 655Phe Val Ile Asp Gly Arg Arg Arg Asp Glu Glu Asn Met Ser Tyr Val
660 665 670Asn Ile Trp Glu Arg Gly Ala Lys Val Ile Gly Val Leu Asn Gly Asp675 680 685Glu Ala Ala Val Ile Leu Gln Thr Met Arg Gly Asn Leu Glu Cys Ile690 695 700Tyr Pro Arg Lys Leu Val Leu Ser Ser Ile Thr Asn Ala Leu Ala Gln705 710 715 720Gln Arg Phe Lys Asp Ala Phe Asn Leu Val Arg Arg His Arg Ile Asp725 730 735Phe Asn Val Ile Val Asp Leu Tyr Gly Trp Gln Ala Phe Leu Gln Ser740 745 750Ala Val Ala Phe Val Glu Gln Val Asn Asn Leu Asn His Val Thr Glu755 760 765Phe Val Cys Ala Met Lys Asn Glu Asp Val Thr Glu Thr Leu Tyr Lys770 775 780Lys Phe Ser Phe Ser Lys Lys Gly Asp Glu Val Phe Arg Val Lys Asp785 790 795 800Ser Cys Ser Asn Lys Val Ser Ser Val Leu Gln Ala Ile Arg Lys Ala805 810 815Leu Glu Glu His Ile Pro Glu Ser Pro Ser Arg Glu Leu Cys Ile Leu820 825 830Thr Thr Leu Ala Arg Ser Asp Pro Pro Ala Ile Glu Glu Ser Leu Leu835 840 845Arg Ile Lys Ser Val Arg Glu Met Glu Leu Leu Asn Ser Ser Asp Asp850 855 860Ile Arg Lys Lys Ser Cys Pro Ser Ala Glu Glu Ala Leu Lys His Leu865 870 875 880Leu Trp Leu Leu Asp Ser Glu Ala Val Phe Glu Ala Ala Leu Gly Leu885 890 895Tyr Asp Leu Asn Leu Ala Ala Ile Val Ala Leu Asn Ser Gln Arg Asp900 905 910Pro Lys Glu Phe Leu Pro Tyr Leu Gln Glu Leu Glu Lys Met Pro Glu
915 920 925Ser Leu Met His Phe Lys Ile Asp Ile Lys Leu Gln Arg Phe Asp Ser930 935 940Ala Leu Arg Asn Ile Val Ser Ala Gly Val Gly Tyr Phe Pro Asp Cys945 950 955 960Met Asn Leu Ile Lys Lys Asn Pro Gln Leu Phe Pro Leu Gly Leu Leu965 970 975Leu Ile Thr Asp Pro Glu Lys Lys Leu Val Val Leu Glu Ala Trp Ala980 985 990Asp His Leu Ile Asp Glu Lys Arg Phe Glu Asp Ala Ala Thr Thr Tyr995 10001005Leu Cys Cys Cys Lys Leu Glu Lys Ala Ser Lys Ala Tyr Arg Glu101010151020Cys Gly Asp Trp Ser Gly Val Leu Arg Val Gly Ala Leu Met Lys102510301035Leu Gly Lys Asp Glu Ile Leu Lys Leu Ala Tyr Glu Leu Cys Glu104010451050Glu Val Asn Ala Leu Gly Lys Pro Ala Glu Ala Ala Lys Ile Ala105510601065Leu Glu Tyr Cys Ser Asp Ile Ser Gly Gly Ile Ser Leu Leu Ile107010751080Asn Ala Arg Glu Trp Glu Glu Ala Leu Arg Val Ala Phe Leu His108510901095Thr Ala Asp Asp Arg Ile Ser Val Val Lys Ser Ser Ala Leu Glu110011051110Cys Ala Ser Gly Leu Val Ser Glu Phe Lys Glu Ser Ile Glu Lys111511201125Val Gly Lys Tyr Leu Thr Arg Tyr Leu Ala Val Arg Gln Arg Arg113011351140Leu Leu Leu Ala Ala Lys Leu Lys Ser Glu Glu Arg Ser Val Val114511501155Asp Leu Asp Asp Asp Thr Ala Ser Glu Ala Ser Ser Asn Leu Ser
116011651170Gly Met Ser Ala Tyr Thr Leu Gly Thr Arg Arg Gly Ser Ala Ala117511801185Ser Val Ser Ser Ser Asn Ala Thr Ser Arg Ala Arg Asp Leu Arg119011951200Arg Gln Arg Lys Ser Gly Lys Ile Arg Ala Gly Ser Ala Gly Glu120512101215Glu Met Ala Leu Val Asp His Leu Lys Gly Met Arg Met Thr Asp122012251230Gly Gly Lys Arg Glu Leu Lys Ser Leu Leu Ile Cys Leu Val Thr123512401245Leu Gly Glu Met Glu Ser Ala Gln Lys Leu Gln Gln Thr Ala Glu125012551260Asn Phe Gln Val Ser Gln Val Ala Ala Val Glu Leu Ala His Asp126512701275Thr Val Ser Ser Glu Ser Val Asp Glu Glu Val Tyr Cys Phe Glu128012851290Arg Tyr Ala Gln Lys Thr Arg Ser Thr Ala Arg Asp Ser Asp Ala129513001305Phe Ser Trp Met Leu Lys Val Phe Ile Ser Pro13101315<210>3<211>3960<212>cDNA<213>拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)<400>3atgaaaaatt tgaagctttt ctcggaggtt cctcagaaca tccaattgca ttcgactgaa 60gaagttgtac agttcgcagc ttatgacatc gaccaaagtc gcttattttt cgcatcttct 120gctaatttcg tttacgccct tcagctctct tccttccaaa atgaaagcgc tggggcaaag 180agtgctatgc ctgtggaggt ctgcagtatt gatattgagc ctggggattt catcacggct 240
ttcgattatc tcgcggagaa ggagtctcta ttaattggga cttctcatgg gcttttgcta 300gtgcataatg tggagagtga tgtgactgag ctagttggaa atatagaagg aggtgtcaag 360tgtatctcgc ctaatccgac tggagatcta cttggattga ttactggtct tgggcagttg 420cttgtaatga cttatgattg ggctttgatg tacgagaagg cgcttggaga ggttcctgaa 480ggtggttacg tacgtgaaac gaatgatttg tctgtaaatt gtgggggtat ttccatttcc 540tggaggggtg atggaaagta ttttgcgact atgggtgagg tttatgagtc tggttgtatg 600tctaagaaga ttaagatatg ggaaagtgat tccggtgctt tgcagtcttc ttcagaaaca 660aaagaattta cgcaggggat tcttgaatgg atgccgagtg gtgctaaaat cgcagctgtt 720tataagagga agtcagatga tagcagtcca tcgattgctt tctttgagag gaatggactt 780gagagaagct cgtttagaat tggtgaacca gaagatgcta cggaatcatg tgaaaatctg 840aaatggaatt ctgcatcaga tcttcttgca ggggttgtta gttgtaaaac atatgatgcc 900attagggtgt ggttctttag caacaaccac tggtacctga aacaggagat taggtatcca 960agggaagctg gggtaacagt catgtgggat ccaacaaagc cactgcagtt aatatgttgg1020actctgtcag ggcaggtgtc tgttcgccac tttatgtggg taacagcggt catggaggac1080tcaacagcct ttgtcataga taactccaag atactcgtga caccactatc tttgtccttg1140atgccacctc ctatgtattt gttcagcctt agtttttctt ctgctgtcag agatatagca1200tattactcaa ggaattctaa gaattgtctg gctgtgtttt tgtcagatgg aaacctgtct1260tttgttgagt tccctgcacc taatacttgg gaagatctcg aaggcaaaga cttcagtgtg1320gaaatttcag actgtaaaac agcactgggc tcttttgtac atcttctatg gttggatgtc1380cactcacttc tgtgtgtctc cgcttatggt tctagccaca acaagtgtct ctcttcggga1440gggtatgaca cagagcttca tggttcttat ttacaagaag ttgaagtagt ctgtcatgag1500gatcatgttc ctgatcaagt gacttgctct ggctttaagg ctagcattac tttccagaca1560cttctcgaat caccggtcct ggctcttgcc tggaatccta gtaagcgtga ttcagccttt1620gtggagtttg agggtgggaa agtgcttgga tatgcgtcaa ggtcagaaat tatggaaact1680cgtagtagtg atgatagtgt atgttttcca tcgacttgtc cttgggtgag ggtggcacag1740gttgatgcta gtggggtgca taaacccttg atatgtgggc ttgatgatat gggtagactg1800tccatcaacg ggaagaacct atgtaataac tgtagcagtt tctcatttta ttcagagttg1860gccaatgaag tagttaccca tctgattatt ttgaccaaac aggattttct ctttattgtc1920gataccaagg atgtactgaa tggagatgtg gcacttggaa atgtgttctt tgttattgat1980ggtagaaggc gagacgagga aaatatgagc tatgttaata tttgggaaag aggtgcaaaa2040gtgataggag tcctcaatgg agatgaagct gctgtgatat tacaaactat gcgggggaat2100ctcgaatgca tatatcccag aaagctggtc ctctcttcca ttacgaatgc gttagctcag2160
caacggttca aagatgcatt taacttggta aggcgtcata gaatcgactt taatgttatc2220gtggatctat atgggtggca ggcatttcta cagtcagccg tagcatttgt tgagcaagta2280aacaatttga accatgttac agaatttgtt tgtgccatga agaatgaaga tgttacagaa2340acgctgtaca aaaagttttc cttttccaaa aagggagacg aggtttttcg tgtgaaagat2400agttgcagta acaaagtatc atcagttcta caggcaatta ggaaggccct tgaagaacat2460atcccagaaa gtccatcaag ggaactctgt attttgacca ctcttgcccg aagtgatcca2520ccagctatcg aagaatctct tttgaggata aaatctgttc gtgaaatgga gttgctaaac2580tcttctgatg atataaggaa aaagtcttgt ccatctgcag aagaagcctt gaaacatctt2640ctgtggttat tggattctga ggctgtcttt gaagctgcct taggtcttta tgatctgaac2700cttgcagcta ttgtggcact caattcccag cgtgatccaa aagaattttt accttatctc2760caggagctgg aaaaaatgcc cgaatccctg atgcatttca agattgacat taaattgcag2820cgttttgata gtgctcttag gaacattgta tcagcagggg ttggctactt tcctgattgc2880atgaacttaa taaagaaaaa ccctcaactt ttccctctgg gcctcctgct aattactgat2940cctgagaaga aactagttgt tctagaggct tgggcagatc acctcattga tgaaaaacgt3000tttgaggatg ctgctactac atacctatgt tgctgtaaac tggaaaaggc ttcaaaggca3060tatcgtgaat gtggtgactg gagtggggta ctccgagtgg gggcgctaat gaaattaggt3120aaagatgaga tcttgaaatt ggcatatgaa ctctgtgaag aggtcaatgc tcttgggaaa3180ccagcggaag cagcaaaaat agcgcttgag tattgcageg atataagcgg tggaattagt3240ttgcttatca atgcgaggga atgggaagag gctttaaggg ttgcattttt gcatacagca3300gatgatagaa tctcagtggt gaaaagttct gctttggagt gtgctagtgg tctagtaagt3360gaattcaaag aatcaataga aaaggtagga aaatatttga ctcgctatct agctgtccgg3420cagagacgat tattgcttgc agcaaagctc aaatccgagg aacgatctgt tgttgatctt3480gacgatgaca cagcttcaga agcaagtagc aacctgagtg gaatgagcgc ctatactttg3540gggacaagga gaggttctgc tgcttcagtc agctcaagca acgctactag cagggcaaga3600gatttgaggc gccagagaaa gagtgggaaa atccgtgctg gcagtgcggg tgaggagatg3660gctcttgttg atcatttgaa aggtatgcgt atgaccgatg gaggaaagcg agagctgaag3720tcgttgttga tatgtctggt aacacttggt gaaatggagt ctgcacagaa gttgcaacag3780actgcagaga atttccaggt ctcccaagta gcagctgtag agctagcaca cgatacagtg3840tccagcgaga gcgtagatga agaagtttat tgctttgaac gttacgctca gaagacgaga3900tccacagcac gagattcaga tgcctttagc tggatgctta aggtcttcat aagcccatga3960
权利要求
1.植物抗逆性相关蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №2；2)将序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且与植物抗逆性相关的蛋白质。
2.权利要求1所述植物抗逆性相关蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于所述植物抗逆性相关蛋白的编码基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
4.根据权利要求2所述的基因，其特征在于所述植物抗逆性相关蛋白的编码基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №3的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
5.含有权利要求2、3或4所述植物抗逆性相关蛋白的编码基因的表达载体。
6.含有权利要求2、3或4所述植物抗逆性相关蛋白的编码基因的细胞系。
7.含有权利要求2、3或4所述植物抗逆性相关蛋白的编码基因的宿主菌。
8.一种利用权利要求2、3或4所述植物抗逆性相关蛋白的编码基因增强植物抗逆性的方法，是抑制植物中的所述植物抗逆性相关蛋白编码基因的表达。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于抑制植物中的所述植物抗逆性相关蛋白编码基因的表达方法包括植物病毒载体介导基因沉默的方法，反义核酸技术沉默基因的方法和siRNA介导的基因沉默方法。
全文摘要
本发明公开了一种植物抗逆性相关蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的植物抗逆性相关蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID№2；2)将序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且与植物抗逆性相关的蛋白质。可利用该植物抗逆性相关蛋白的编码基因增强植物抗逆性，如抑制植物中的上述植物抗逆性相关蛋白编码基因的表达。
文档编号C12N15/29GK1683398SQ20051005398
公开日2005年10月19日 申请日期2005年3月15日 优先权日2005年3月15日
发明者巩志忠, 洪旭晖, 陈智忠, 张海荣, 周晓锋, 任小峙 申请人:中国农业大学