专利名称：新疆雪莲冷调节蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物冷调节蛋白及其编码基因与应用，特别是源于新疆雪莲中冷调节蛋白编码基因、冷调节蛋白及其应用。
背景技术：
低温是农业生产中一种主要的环境限制因素，低温灾害引起农作物大幅度减产是世界范围内普遍存在的问题，每年全世界仅用于减轻霜冻的危害应需要花费1亿多美元(Pearce，1999)。然而有些植物能够长期耐受住低于冰点的温度。在1970年Weiser提出低温锻炼可能会引起基因表达改变的设想。随后发现大多数植物在低温锻炼过程中均有冷调节物质的存在。Guy等研究发现冷训化能诱导和增加一些基因的表达，使多种基因表达发生改变。Mohapatra等、Houde等在苜蓿中已分离到多种冷驯化特异的cDNA，cf对脱落酸诱导、脱水或热休克处理诱导的转录累积与冰冻耐受性明显正相关。Artus N.N.等，使拟南芥抗冻相关基因cor15am转入拟南芥中大量表达后，与野生型相比转基因植物分别提高叶绿体和原生质体的耐寒性，并增强原生质膜稳定性。
新疆雪莲(Sasussured involucrata Kar.et Kir.)属菊科风毛菊属，仅存在于中国新疆，为多年生一次性开花结实的高山草本植物，一般生长在海拔2400-4100米的高山上，研究表明雪莲的抗寒性能极为突出，冬季-30℃甚至更低的严寒能顺利越冬，其体内存在着在丰富的抗寒资源。通过分离及克隆新疆雪莲中与抗冻相关的基因，利用基因工程技术可以把对霜冻敏感的农作物改造成耐霜冻的农作物，并延长作物的生长期，可以给农业生产带来巨大收益。
发明内容
本发明的目的是提供新疆雪莲的一个冷调节蛋白XLCOR及其编码基因，该蛋白对雪莲的抗寒有调节作用。
本发明提供的一种新疆雪莲冷调节蛋白XLCOR编码基因，是下列核苷酸序列之一1)、SEQ ID NO1的DNA序列；或与2)、SEQ ID NO1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
本发明所提供的新疆雪莲的冷调节蛋白XLCOR具有SEQ ID NO1编码新疆雪莲冷调节蛋白的基因由650个碱基组成，该基因的读码框为自5’端第65到第571位碱基。
本发明提供了新疆雪莲的冷调节蛋白XLCOR具有SEQ ID NO2的氨基酸残基序列。
本发明所提供的新疆雪莲冷调节蛋白XLCOR序列SEQ ID NO2由170个氨基酸残基组成。
本发明同时提供了新疆雪莲的冷调节蛋白XLCOR由SEQ ID NO2衍生的蛋白质，其特征在于将SEQ ID NO2中的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代具有与SEQ ID NO2中氨基酸序列相同活性。
本发明同时提供了新疆雪莲的冷调节蛋白XLCOR由SEQ ID NO2衍生的蛋白质，其特征在于将SEQ ID NO2中的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的缺失具有与SEQ ID NO2中氨基酸序列相同活性。
本发明同时提供了新疆雪莲的冷调节蛋白XLCOR由SEQ ID NO2衍生的蛋白质，其特征在于将SEQ ID NO2中的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的添加具有与SEQ ID NO2中氨基酸序列相同活性。
本发明还提供新疆雪莲冷调节蛋白XLCOR编码基因的表达载体，其特征在于可使用任何一种可以转导外源基因在植物中表达的表达载体转化植株，都可获得对低温胁迫耐受力得到增强的转基因植株。
本发明还提供新疆雪莲冷调节蛋白XLCOR编码基因的表达载体可包括双元农杆菌载体以及用于单子叶植物微弹轰击的载体。
本发明还提供新疆雪莲冷调节蛋白XLCOR编码基因的表达载体还可包括3’非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它的可效应mRNA加工或基因表达的DNA片断。
本发明提供的新疆雪莲冷调节蛋白XLCOR编码基因在构建到植物表达载体中，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种强启动子或诱导型启动子，其特征在于可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。
本发明提供的新疆雪莲冷调节蛋白XLCOR编码基因在构建到植物表达载体中，在其转录起始核苷酸前也可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，其特征在于增强子区域可以是ATG起始密码子和邻接区域起始密码子，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证序列的翻译。
本发明所提供的新疆雪莲冷调节蛋白XLCOR编码基因在应用在转基因植物中，如需要对转基因植物或植物进行鉴定及筛选时，可对所使用的载体进行加工，包括加入植物可选择性标记，也可不用任何筛选标记。
本发明所提供的新疆雪莲冷调节蛋白XLCOR编码基因在抗寒植物品种中具有广泛的的应用，其特征在于包括本发明的冷调节蛋白XLCOR编码基因的植物表达载体转化植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，可培育出抗寒的植物品种。
本发明所提供的编码冷调节蛋白XLCOR的基因，可使用任何一种可以转导外源基因在植物中表达的表达载体(这些植物表达载体包括双元农杆菌载体以及用于单子叶植物微弹轰击的载体)转化植株，都可获得对低温胁耐受力得到增强的转基因植株。载体还可包括3’非翻译区域，包含聚腺苷酸信号和任何其它的可效应mRNA加工或基因表达的DNA片断。聚腺苷酸信号引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。3’区域的例子有农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大事贮存蛋白基因)3’转录的非翻译区等。本发明的XLCOR基因的3’非翻译区域可被用于在植物中表达。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种强启动子或诱导型启动子。这些启动子很多，如花椰菜花叶病毒(CAMV 35S)和Ubiqutin启动子等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。本发明的1个基因在构建到植物表达载体中时，也可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子。这些增强子区域可以是ATG起始密码子和邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整修序列的翻译。翻译控制信号和起始密码子可以是天然或合成等多种不同来源的。翻译起始区域可以来自起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，包括加入植物可选择性标记。使用的选择性标记可以是编码对抗生素抗性酶的基因，抗生素包括庆大霉素、潮霉素、卡那霉素等。也可以是产生颜色变化的酶或发光化合物的茵，如GUS、荧光酶，还可以是抗化学试剂(例如除莠剂)的基因。当然，也可以不用任何筛选标记。
携带本发明XLCOR基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物(Weissbach，1998，method for Plant Molecular Biology VIII，Academy Press，Now York，pp 421-463；Geiserson and Corey，1998，plant MolecularBiolory(2nd Editon)。
可使用包括本发明的冷调节蛋白基因的植物表达载体转化植物宿主，既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如水稻、小麦、棉花、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜蓿等，可培育抗寒的植物品种。
图1基因文库杂交结果。
图中前一个图为正向差减文库杂交结果；后一个图为反向差减文库杂交结果。
图2基因文库杂交结果。
图中A点为探针与20℃培养的新疆雪莲组织培养幼苗的总RNA的杂交结果，B点为为阳性对照，C点为探针与4℃培养的新疆雪莲组织培养幼苗的总RNA的杂交结果。
具体实施例实施例1、新疆雪莲cDNA文库的构建采集生长于天山海拔4000米的新疆雪莲叶片，称取0.1g在液氮中研碎，加入1mlTRIZOL试剂，充分混匀，加入200ul氯仿，混匀，离心取上清，加入250ul异丙醇，离心去上清，经75％乙醇洗涤后，在室温干燥，沉淀用15ulDEPC水溶解。严格按照BD Biosciences公司“SMART cDNA Library Contruction Kit”使用手册，取1ug总RNA，在PowerScript反转录酶的作用下合成双链cDNA，经蛋白酶K及限制性内切酶Sfi I处理后，用CHROMA SPIN-400柱子进行分级分离，与载体λTrip1EX2连接，连接产物用λ噬菌体包装蛋白进行包装，所获得文库经滴度测定后，保存于-70℃。
实施例2、新疆雪莲cDNA差减文库的构建将新疆雪莲组织培养苗在0℃-2℃处理两星期，用未经低温处理的新疆雪莲组织培养苗作为对照，按照BDBioxciences公司的“Clontech PCR-Select cDNASubtraction Kit”使用使用手册，分别提取两种组织培养苗总RNA，分离其PolyA+RNA，合成双链cDNA。对低温处理的组织培养苗分别加上不同的接头，作为“测试cDNA”(Tester cDNA)，未经低温处理的组织培养苗作为“驱动cDNA”(DrivercDNA)，经过两次杂交后，对杂交产物进行PCR反应，获得新疆雪莲在低温下特异表达的cDNA，将这些cDNA与T-载体进行连接，构建得到新疆雪莲cDNA低温正向差减文库；同时对常温生长的组织培养苗cDNA分别加上不同的接头，作为“测试cDNA”(Tester cDNA)，低温诱导的组织培养苗作为“驱动cDNA”(DrivercDNA)，经过两次杂交后，对杂交产物进行PCR反应，，将这些cDNA与T-载体进行连接，构建得到新疆雪莲cDNA低温反向差减文库。
实施例3、新疆雪莲冷调节基因XLCOR的克隆从新疆雪莲cDNA低温正向差减文库和反向差减文库中各挑取300个克隆，提取质粒后，进行PCR反应，获得全长cDNA，将其点于尼龙膜上；对制备的低温正向差减cDNA用地高辛(可通过市场购买)进行标记后作为探针，与点好的cDNA进行杂交。杂交结果参见图1所示。图中A为正向差减文库杂交结果，图中B为反向差减文库杂交结果。将两张膜进行比较，挑选在正向差减文库中有杂交信号，而在反向杂交库中没有杂交信号的的cDNA进行序列测定。测序结果在GENEBANK中进行序列比较后，得到新疆雪莲冷调节基因XLCOR。
实施例4、新疆雪莲冷调节基因XLCOR与低温胁迫的关系将新疆雪莲组织培养幼苗在2℃培养14天，称取0.1g叶片在液氮中研碎，加入1mlTRIZOL试剂，充分混匀，加入200ul氯仿，混匀，离心取上清，加入250ul异丙醇，离心去上清，经75％乙醇洗涤后，在室温干燥，沉淀用15ul DEPC水溶解，得到其总RNA。按同样的方法提取20℃培养的新疆雪莲组织培养幼苗的总RNA，以冷调节基因XLCOR为探针，分别与上述两个RNA样品进行Northern杂交，杂交结果参见图2所示。图中A点为探针与20℃培养的新疆雪莲组织培养幼苗的总RNA的杂交结果，B点为阳性对照，C点为探针与4℃培养的新疆雪莲组织培养幼苗的总RNA的杂交结果。结果表明，该冷调节基因受低温诱导，在常温培养下不表达。
序列表<110>新疆农业科学院微生物应用研究所<120>新疆雪莲冷调节蛋白及其编码基因与应用<130>111<160>2<170>Patent In version 3.3<210>1<211>650<212>DNA<213>新疆雪莲Sasussured involucrata Kar.et Kir.
<220>
<221>5′UTR<222>(1)..(64)<220>
<221>CDS<222>(65)..(571)<220>
<221>3′UTR<222>(572)..(650)<400>1atctccaaca acccaaatta aaaagaagaa taaaaacaag attgtgaaag ttgaaggtct60aaca atg gcg aat gca agt gat gag ttc agg gtg gca tct tcc ggc atc109Met Ala Asn Ala Ser Asp Glu Phe Arg Val Ala Ser Ser Gly Ile1 5 10 15gat cat gaa ggc cgt ctt cca cga aaa tac acc gcc gaa ggt caa ggt 157Asp His Glu Gly Arg Leu Pro Arg Lys Tyr Thr Ala Glu Gly Gln Gly20 25 30aca aag aaa gac ata tcg cca cca ata gaa tgg cac aat gtt ccc gat 205Thr Lys Lys Asp Ile Ser Pro Pro Ile Glu Trp His Asn Val Pro Asp35 40 45gag acg aaa aca tta gca cta gtg gtc gag gat atc aac gaa gca gac 253Glu Thr Lys Thr Leu Ala Leu Val Val Glu Asp Ile Asn Glu Ala Asp50 55 60ccc agt ggt atg ctc gtt cct tgg aca ttg tgg gtg gtg atc aat ata 301
Pro Ser Gly Met Leu Val Pro Trp Thr Leu Trp Val Val Ile Asn Ile65 70 75cca ccc acc tta aaa ggg ttg ccg gag ggg ttt tcc ggc aaa gaa gag349Pro Pro Thr Leu Lys Gly Leu Pro Glu Gly Phe Ser Gly Lys Glu Glu80 85 90 95gac aac ggt gag gct tcc gct aac att aaa gaa ggg aac aat gat ttt397Asp Asn Gly Glu Ala Ser Ala Asn Ile Lys Glu Gly Asn Asn Asp Phe100 105 110aag gtg ccg gga tgg agc ggc cca aag atg ccg tca ccg gga cat aga445Lys Val Pro Gly Trp Ser Gly Pro Lys Met Pro Ser Pro Gly His Arg115 120 125ttt gag ttc aag ctt tat gcg ttg gat act gaa att gat ttg gga aat493Phe Glu Phe Lys Leu Tyr Ala Leu Asp Thr Glu Ile Asp Leu Gly Asn130 135 140aag gtg aca aag gaa aag cta cta gat gca att gat ggg cat gtg ctt541Lys Val Thr Lys Glu Lys Leu Leu Asp Ala Ile Asp Gly His Val Leu145 150 155gag gaa gcc gtt cta acg gca tta tat gaa tagcgttgtt ttggttgggt 591Glu Glu Ala Val Leu Thr Ala Leu Tyr Glu160 165cgagaatagt gcgttagtgc tatacttcta tgtaaggttt aattttgatt ttgtactcg 650<210>2<211>169<212>PRT<213>新疆雪莲Sasussured involucrata Kar.et Kir.
<400>2Met Ala Asn Ala Ser Asp Glu Phe Arg Val Ala Ser Ser Gly Ile Asp1 5 10 15His Glu Gly Arg Leu Pro Arg Lys Tyr Thr Ala Glu Gly Gln Gly Thr20 25 30Lys Lys Asp Ile Ser Pro Pro Ile Glu Trp His Asn Val Pro Asp Glu35 40 45Thr Lys Thr Leu Ala Leu Val Val Glu Asp Ile Asn Glu Ala Asp Pro50 55 60
Ser Gly Met Leu Val Pro Trp Thr Leu Trp Val Val Ile Asn Ile Pro65 70 75 80Pro Thr Leu Lys Gly Leu Pro Glu Gly Phe Ser Gly Lys Glu Glu Asp85 90 95Asn Gly Glu Ala Ser Ala Asn Ile Lys Glu Gly Asn Asn Asp Phe Lys100 105 110Val Pro Gly Trp Ser Gly Pro Lys Met Pro Ser Pro Gly His Arg Phe115 120 125Glu Phe Lys Leu Tyr Ala Leu Asp Thr Glu Ile Asp Leu Gly Asn Lys130 135 140Val Thr Lys Glu Lys Leu Leu Asp Ala Ile Asp Gly His Val Leu Glu145 150 155 160Glu Ala Val Leu Thr Ala Leu Tyr Glu16权利要求
1.一种雪莲冷调节蛋白XLCOR编码基因，该蛋白基因包含SEQ ID NO2所示的核苷酸序列；
2.一种编码SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；
3.如权利要求2所述的核苷酸序列，该序列如SEQ ID NO1所示；
4.一种如权利要求2所述的SEQ ID NO2序列洐生的蛋白质，其特征在于将SEQ ID NO2中的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代具有与SEQ ID NO2中氨基酸序列相同活性；
5.一种如权利要求2所述的SEQ ID NO2序列洐生的蛋白质，其特征在于将SEQ ID NO2中的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的缺失具有与SEQ ID NO2中氨基酸序列相同活性；
6.一种如权利要求2所述的SEQ ID NO2洐生的蛋白质，其特征在于将SEQ ID NO2中的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的添加具有与SEQ ID NO2中氨基酸序列相同活性；
7.一种如权利要求3所述的SEQ ID NO1序列，其特征在于与SEQ IDNO1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
8.一种表达载体，其含有如权利要求2至7任一项所述的新疆雪莲冷调节蛋白XLCOR编码基因的表达载体；
9.如权利要求8所述的表达载体，其特征在于可使用任何一种可以转导外源基因在植物中表达的表达载体转化植株，都可获得对低温胁耐受力得到增强的转基因植株；
10.一种权利要求2至7任一种新疆雪莲冷调节蛋白XLCOR编码基因在抗寒植物品种中的应用，其特征在于，包括本发明的冷调节蛋白XLCOR编码基因的植物表达载体转化植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，可培育出抗寒的植物品种。
全文摘要
本发明公开了来源于新疆雪莲的冷调节蛋白及基编码基因与应用，目的是提供具有较强抗寒性能的冷调节蛋白及其编码基因。本发明所提供的冷调节蛋白名称是XLCOR，是具有序列表中序列2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将序列2中的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2中氨基酸序列相同活性由序列2衍生的蛋白质。冷调节蛋白XLCOR的编码基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的序列有90％以上的同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。本发明的基因对培育抗寒植物品种，提高农作物产量具有重要意义。
文档编号C12N15/63GK1821405SQ200510053240
公开日2006年8月23日 申请日期2005年2月17日 优先权日2005年2月17日
发明者王志方, 王博, 艾秀莲 申请人:新疆农业科学院微生物应用研究所