专利名称：肠出血性大肠杆菌o157核酸检测方法及其检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种肠出血性大肠杆菌的检测，尤其是涉及一种采用等长双链荧光探针技术对肠出血性大肠杆菌0157进行检测的方法及其检测试剂盒。
背景技术：
肠出血性大肠杆菌0157(E.coli 0157)是致泻性大肠杆菌的一种主要的血清型，它可引起出血性肠炎，伴有剧烈腹痛、发热，严重的可造成肾功能不全、溶血性尿毒综合症(HUS)、溶血性贫血、血小板减少性紫癜，甚至因急性和慢性肾功能衰竭而死亡。E.coli 0157引发的食物中毒在美国、日本、英国、加拿大、澳大利亚等发达国家接连不断发生。1993年，美国发生了一次涉及到4个州700余名儿童感染的暴发流行，其中51例发生了溶血性尿毒综合症(HUS)，4例死亡，至1995年底，美国共暴发流行近50起，每年约2万人感染。特别是1996年5～8月份，日本发生由0157污染萝卜苗及牛肉而导致的集体食物中毒事件，波及东京、大阪、京都等40多个都府县，患者累计达9000余人，7人死亡。我国于1987年首次从出血性结肠炎患者中分离到0157型大肠杆菌，目前尚未发现暴发流行，但多次于山东、江苏、河北、河南等地的腹泻患者中检测出0157。因此对于E.coli 0157的监测和检测对于我国人民的饮食卫生安全具有重要意义。
传统的病原微生物分离、培养与鉴定需时较长，难以适应E.coli 0157流行时诊断、治疗的需要，其鉴定慢、灵敏度低的缺点向微生物检验提出了更高的要求——更准确、更快速、更安全地检出与监测病原体。虽然各类PCR技术的应用已明显加快了微生物检验的速度，但是由于PCR过程中操作易造成污染而产生假阳性结果和样品中PCR抑制物的存在而产生假阴性结果，这又限制了PCR技术对E.coli 0157检测的应用。
实时荧光PCR技术的产生不但很好地解决了PCR的定量问题，同时其闭管操作、实时检测解决了PCR产物琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳等后续工作，简化了步骤，很好地避免了PCR产物的交叉污染，提高了检测的特异性。
目前，应用实时荧光PCR技术对肠出血性大肠杆菌0157进行检测有分子信标(NathalieY.Fortin，Ashok Mulchandani，and Wilfred Chen.Use of Real-time Polymerase ChainReaction and Molecular Beacons for the detection of Escherichia coli0157H7.Analytical Biochemiotry.2001，289281-288)和Taqman探针(A.Mark Ibckwc，Pamela M.Watt，Catherine M.Grieve，Vijay K.Sharma，and Steven R.Lyons.MultiplexFluorogenic Real-time PCR for Detection and Quantification of Escherichia coli0157H7 in Dairy Wastewater Wetlands.Applied And Environmental Microbiology.2002，4853-4862；Vijay K.Sharma，Evelyn A.Dean-Nystrom.Detection of enterohemorrhagicEscherichia coli 0157H7 by using a multiplex real-time PCR assay for genes encodingintimin and Shiga toxins.Veterinary Microbiology.2003，93247-260)等。探针的识别增强了实验的可靠性，但是存在探针和实验的设计过于复杂和实验成本过高的问题。
发明内容
本发明旨在针对现行的E.coli 0157检测方法鉴定慢，灵敏度低，特异性差，难以适应流行时诊断、治疗的问题，提供一种操作简便、实验可靠性高、可进行实时检测、灵敏度高、特异性好、周期短的肠出血性大肠杆菌0157核酸检测方法及其试剂盒。为此，本发明采用等长双链荧光探针进行核酸检测的技术方案。
本发明所说的肠出血性大肠杆菌0157核酸检测方法如下1)将肠出血性大肠杆菌0157特有的保守序列作为待测靶基因，长度为100-350bp，优选100-250bp。
2)根据待测靶基因合成一对与待测靶基因相应的特异性引物，引物长度为18-30bp，退火温度为45-60℃，优选50℃。
3)根据待测靶序列中位于两个引物之间的序列合成一对等长双链特异性探针，具体要求如下a.所说的一对等长双链特开性探针的长度为18-30bp，探针的退火温度为50-70℃；b.标记荧光剂的链与待测靶基因序列完全匹配，另一条链标记淬灭剂；c.两条链的3’端封闭；d.两条链的一个末端存在碱基完全不匹配，不匹配的碱基长度为2-10bp，优选5bp。
4)使用步骤2)中的上、下游引物和步骤3)中的探针及其它PCR成份组成荧光PCR反应体系的检测溶液混合物，所说的其它PCR成分包括1.5-3.5mM MgCl2，2μl 10×PCR缓冲液，0.1-3mM dNTPs，1-3U Taq酶，所说的上下游引物各为0.2-0.6μM，所说的探针为荧光剂标记探针0.05-0.3μM，粹灭剂标记探针0.06-0.36μM。
5.阳性对照模板包含待测靶基因的被检测DNA。
6.阴性对照模板灭菌后的无离子水。
7.实时荧光PCR反应条件 实时荧光PCR反应条件最好为 在步骤1)中，所说的序列优选如下序列TGAAGGTGGAATGGTTGTCACGAATGACAAAACACTTTATGACCGTTGTTTACATTTTAAAGGCCAAGGATTAGCTGTACATAGGCAATATTGGCATGACGTTATAGGCTACAATTATAGGATGACAAATATCTGCGCTGCT长度为142bp。
另外，肠出血性大肠杆菌0157特异性引物的反应浓度优选0.4μM。
在步骤2)中，所说的引物优选如下引物上游引物5‘-TGA AGG TGG AAT GGT TGT CA-3’20bp Tm＝53.4℃下游引物5‘-AGC AGC GCA GAT ATT TGT CA-3’20bp Tm＝53.4℃在步骤3)中，所说的探针的序列优选为与靶基因完全匹配链(标记荧光剂)GGC CAA GGA TTA GCT GTA CAT AGG CA 26bp Tm＝61.2℃不完全互补链(标记淬灭剂)ACG GAA TGT ACA GCT AAT CCT TGG CC 26bp Tm＝61.2℃另外，等长双链荧光探针与靶基因完全匹配链的5’端用FAM荧光剂标记，3’端磷酸化封闭；另一条链的3’端用Dabcyl粹灭剂封闭，与荧光剂标记的链有5个碱基不互补与靶基因完全匹配链FAM-5‘-GGC CAA GGA TTA GCT GTA CAT AGG CA-3’-phosphorylation不完全互补链5‘-ACG GAA TGT ACA GCT AAT CCT TGG CC-3’-Dabcyl在步骤4)中，混合物中MgCl2的浓度优选2.5mM，dNTPs的浓度优选0.25mM，Taq酶的浓度优选1.8U。
本发明所说的肠出血性大肠杆菌0157的等长双链探针核酸检测试剂盒设有盒体、盒盖，在盒体里设有垫体，垫体上设有至少可分别隔离放置4个Effendorf管，分别装有Taq酶、阴性对照模板、阳性对照模板和混合物的空腔，所说的混合物包括MgCl2、dNTPs、10×PCR缓冲液、引物和探针。
试剂盒检测溶液最好保存于-20℃冰箱。
与已有的E.coli 0157检测方法相比，本发明的优点是1)检测方法鉴定方法快，实用性好，可以直接取菌进行实时荧光PCR核酸检测，省去了分离、培养，提取细菌DNA的过程，可以快速完成对于E coli 0157的检测，提高检测的效率，操作简便、实验可靠性高，周期短。
2)特异性好，应用特异的上下游引物扩增目的片断，再通过高度特异的等长双链探针进行实时检测，对于0157的检测可以达到95％以上，可适应流行时的诊断与治疗问题。
3)灵敏度高当从浓度约为1.49×103CFU/ml样品中取1μl，应用试剂盒即可以检测出阳性的结果。
图1为等长荧光探针对不同来源(样品来源于污染的水、食品、人畜粪便等)0157的检测结果。
图2为等长荧光探针对0157、志贺氏菌、侵袭性大肠埃希菌(EIEC)和沙门氏菌的检测结果。
图3为等长荧光探针对不同浓度梯度0157的检测结果。在图3中，曲线1，2，3，4代表样品浓度分别为1.49×106，1.49×105，1.49×104，1.49×103 CFU/ml，曲线5为空白对照，曲线6为阴性对照模板。
在图1-3中，横坐标为循环数，纵坐标为相应的荧光值。
具体实施例方式
本发明所说的肠出血性大肠杆菌0157的等长双链探针核酸检测试剂盒设有盒体、盒盖，在盒体里设有垫体，垫体上设有至少可分别隔离放置4个Effendorf管，分别装有Taq酶、阴性对照模板、阳性对照模板和混合物的空腔，所说的混合物包括MgCl2、dNTPs、10×PCR缓冲液、引物、探针。试剂盒检测溶液最好保存于-20℃冰箱，其保持期可达1年。
实施例1等长荧光探针对0157的实时荧光PCR检测取1μl样品加入到检测试剂盒的检测溶液Mixs中，终体积为20μl。实时荧光PCR的反应程序为PCR扩增程序为94℃变性3min，进入循环，94℃变性15s，55℃退火20s，72℃延伸20s，40个循环，[Gain Fam]＝9。荧光信号强度在退火阶段采集。
实施例2等长荧光探针对不同来源0157的检测(样品来源于污染的水，食品，人畜粪便等)
分别取不同样品各1μl加入检测溶液，按照实施程序的方法进行实时荧光PCR反应，不同样品的荧光强度有不同高度的升起，代表了阳性结果。(参见图1)实施例3等长荧光探针对0157，志贺氏菌，侵袭性大肠埃希菌(EIEC)，沙门氏菌的检测分别取0157，志贺氏菌，侵袭性大肠埃希菌(EIEC)，沙门氏菌样品各1μl加入检测溶液，按照实施程序的方法进行实时荧光PCR反应，荧光强度有升起，代表了阳性结果.(参见图2)实施例4等长荧光探针对不同浓度梯度0157的检测将已知浓度的阳性样品按10-1，10-2，10-3，10-4，10-5等梯度稀释，分别取各个梯度的样品1μl加入检测溶液，按照实施程序的方法进行实时荧光PCR反应，不同梯度的样品的荧光强度在不同的循环数升起。由此可以判断试剂盒的灵敏度。1.49×102到1.49×106做梯度检测，可以从浓度为1.49×103CFU/ml的样品中取1μl即可检测出阳性。(参见图3)
权利要求
1.肠出血性大肠杆菌0157核酸检测方法，其特征在于其步骤为1)将肠出血性大肠杆菌0157特有的保守序列作为待测靶基因，长度为100-350bp；2)根据待测靶基因合成一对与待测靶基因相应的特异性引物，引物长度为18-30bp，退火温度为45-60℃；3)根据待测靶序列中位于两个引物之间的序列合成一对等长双链特异性探针，具体要求如下a.所说的一对等长双链特异性探针的长度为18-30bp，探针的退火温度为50-70℃；b.标记荧光剂的链与待测靶基因序列完全匹配，另一条链标记淬灭剂；c.两条链的3’端封闭；d.两条链的一个末端存在碱基完全不匹配，不匹配的碱基长度为2-10bp；4)使用步骤2)中的上、下游引物和步骤3)中的探针及其它PCR成份组成荧光PCR反应体系的检测溶液混合物，所说的其它PCR成分包括1.5-3.5mM MgCl2，2μl 10×PCR缓冲液，0.1-3mM dNTPs，1-3U Taq酶，所说的上下游引物各为0.2-0.6μM，所说的探针为荧光剂标记探针0.05-0.3μM，粹灭剂标记探针0.06-0.36μM；5)阳性对照模板包含待测靶基因的被检测DNA；6)阴性对照模板灭菌后的无离子水；7)实时荧光PCR反应条件
2.如权利要求1所述的肠出血性大肠杆菌0157核酸检测方法，其特征在于在步骤1)中，所说的特有的保守序列长度为100-250bp。
3.如权利要求1所述的肠出血性大肠杆菌0157核酸检测方法，其特征在于在步骤1)中，所说的序列优选如下序列TGAAGGTGGAATGGTTGTCACGAATGACAAAACACTTTATGACCGTTGTTTACATTTTAAAGGCCAAGGATTAGCTGTACATAGGCAATATTGGCATGACGTTATAGGCTACAATTATAGGATGACAAATATCTGCGCTGCT长度为142bp。
4.如权利要求1所述的肠出血性大肠杆菌0157核酸检测方法，其特征在于在步骤1)中，肠出血性大肠杆菌0157特异性引物的反应浓度优选0.4μM。
5.如权利要求1所述的肠出血性大肠杆菌0157核酸检测方法，其特征在于在步骤2)中，所说的退火温度为50℃。
6.如权利要求1所述的肠出血性大肠杆菌0157核酸检测方法，其特征在于在步骤2)中，所说的引物优选如下引物上游引物5‘-TGA AGG TGG AAT GGT TGT CA-3’20bp Tm＝53.4℃下游引物5‘-AGC AGC GCA GAT ATT TGT CA-3’20bp Tm＝53.4℃
7.如权利要求1所述的肠出血性大肠杆菌0157核酸检测方法，其特征在于在步骤3)中，所说的不匹配的碱基长度为5bp；所说的探针的序列优选为与靶基因完全匹配链(标记荧光剂)GGC CAA GGA TTA GCT GTA CAT AGG CA 26bp Tm＝61.2℃不完全互补链(标记淬灭剂)ACG GAA TGT ACA GCT AAT CCT TGG CC 26bp Tm＝61.2℃等长双链荧光探针与靶基因完全匹配链的5’端用FAM荧光剂标记，3’端磷酸化封闭；另一条链的3’端用Dabcyl粹灭剂封闭，与荧光剂标记的链有5个碱基不互补。
8.如权利要求1所述的肠出血性大肠杆菌0157核酸检测方法，其特征在于在步骤4)中，使用步骤2)中的上、下游引物和步骤3)中的探针及其它PCR成份组成荧光PCR反应体系的检测溶液混合物，所说的其它PCR成分包括1.5-3.5mM MgCl2，2μl 10×PCR缓冲液，0.1-3mM dNTPs，1-3U Taq酶，所说的上下游引物各为0.2-0.6μM，所说的探针为荧光剂标记探针0.05-0.3μM，粹灭剂标记探针0.06-0.36μM。
9.如权利要求1所述的肠出血性大肠杆菌0157核酸检测方法，其特征在于在步骤4)中，混合物中MgCl2的浓度优选2.5mM，dNTPs的浓度优选0.25mM，Taq酶的浓度优选1.8U。
10.肠出血性大肠杆菌0157的等长双链探针核酸检测试剂盒，其特征在于设有盒体、盒盖，在盒体里设有垫体，垫体上设有至少分别隔离放置4个Effendorf管，分别装有Taq酶、阴性对照模板、阳性对照模板和混合物的空腔，所说的混合物包括MgCl2、dNTPs、10×PCR缓冲液、引物、探针。
全文摘要
肠出血性大肠杆菌O157核酸检测方法及其试剂盒，涉及一种采用等长双链荧光探针技术对肠出血性大肠杆菌O157进行检测的方法及其试剂盒。提供一种操作简便、实验可靠性高、可进行实时检测、灵敏度高、特异性好、周期短的肠出血性大肠杆菌O157核酸检测方法及其试剂盒。其步骤为将肠出血性大肠杆菌O157特有的保守序列作为待测靶基因；根据待测靶基因合成一对特异性引物；合成一对等长双链特异性探针；组成荧光PCR反应体系的检测溶液混合物；阳性对照模板包含待测靶基因的被检测DNA；阴性对照模板灭菌后的无离子水。
文档编号C12Q1/68GK1680602SQ20051005231
公开日2005年10月12日 申请日期2005年2月5日 优先权日2005年2月5日
发明者陈亮, 于广福, 邵寒娟, 牛建军 申请人:厦门大学