稻的邻氨基苯甲酸合成酶基因oasa2的新改良基因及其用途的制作方法

专利名称：：稻的邻氨基苯甲酸合成酶基因oasa2的新改良基因及其用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及稻的邻氨基苯甲酸合成酶基因OASA2的新改良基因及其用途，尤其是涉及编码与野生型稻邻氨基苯甲酸合成酶的活性相等或超出，并且对色氨酸所产生的反馈抑制具有抗性的改良的稻邻氨基苯甲酸合成酶的新改良基因及其用途。
背景技术：
：色氨酸是构成蛋白质的氨基酸的其中一种，是生物生存所不可缺少的。由于动物无法在体内合成色氨酸，因此不得不从食物中摄取。稻，玉米、小麦等谷物由于色氨酸的含量非常少，因此需要在普通的谷物饲津牛中添加工业制造的色氨酸。已知在色氨酸的生物合成途径中，由分支酸生物合成邻氨基苯甲酸，但是邻氨基苯甲酸的生成与邻氨基苯曱酸合成酶的催化剂作用相关，由此生成邻氨基苯甲酸，再由邻氨基苯甲酸通过6阶段的酶促反应途经p引咮生成色氨酸(参照非专利文献1)。发明人发现了稻邻氨基苯甲酸合成酶的2个a亚基基因OASA1和OASA2，并将它们分离出来(参照专利文献l)。而且据报道，对它们的特征进行了详细的研究，其结果是，发明人认为基因表达量多、并且在稻中编码主要作为邻氨基苯曱酸合成酶a亚基行使功能的蛋白质的基因是OASA2(参照非专利文献2)。进而，发明人报道了OASA2蛋白对色氨酸浓度的敏感性极高，伴随细胞内的色氨酸浓度上升，OASA2蛋白活性降低(参照非专利文献3)。因此，认为如果可以改变OASA2蛋白的功能，就可以制备积累了高浓度的色氨酸的新品种的植物。关于稻邻氨基苯甲酸合成酶基因的改变，发明人报道了对色氨酸反馈抑制抗性的变异OASA1蛋白，例如通过将稻邻氨基苯曱酸合成酶第1同功酶a亚基OASAl蛋白的第323位的天冬氨酸残基取代为天冬酰胺残基(D323N)的变异OASA1蛋白进行转化，所获得的色氨酸反馈抑制抗性变异体0ASA1D,愈伤组织中游离的色氨酸量比野生型中增加了180倍、重组稻中比野生型中游离的色氨酸量增加了35倍(参照非专利文献2)。另一方面，最近人们认为在基因中随机地导入变异，筛选其变异基因的产物-变异蛋白质的功能需要大量时间和劳力。而且，在目的位置同时导入多个变异，采用随机导入变异的方法是极为困难的，并且几乎不可能。专利文献1国际/^开第WO99/11800号非专利文献l生化学实-睑讲座、第11巻、东京化学同人、1976年、652页~653页非专利文献2TozawaY,HasegawaH，TerakawaT和WakasaK(2001)CharacterizationofriceanthranilatesynthasealfasubunitgenesOSASAlandOSASA2:tryptophanaccumulationintransgenicriceexpressingafeedback-insensitivemutantofOASAl(邻氛基苯甲酸合成酶oc亚单位基因OSASAl和OSASA2:表达反馈不敏感的OASA1变异株的转基因稻中的色氨酸积聚).PlantPhysiology(植物生理学)126:1493-1506非专利文献3TakuyaKanno，KojiKasai，YasukoIkejiri-Kanno，KyoWakasa和YuzuruTozawa(2004)Invitroreconstitutionofriceanthranilatesynthase:DistinctfunctionalpropertiesofthealphasubunitsOASA1andOASA2(稻邻氨基苯甲酸合成酶的体外重组oc亚单位OSASAl和OSASA2独特的功能特性).PlantMolecularBiology(植物分子生物学)54:11-22
发明内容如上所述，在谷物饲料中添加工业制备的色氨酸，由于色氨酸比其它氨基酸价格高，因此希望制备色氨酸含量高的谷物。因此，如果通过在稻邻氨基苯曱酸合成酶基因OASA2中导入变异，可以将OASA2蛋白的功能改变，即使细胞内的色氨酸浓度上升，酶活性也不降低，就可以制备积累了高浓度色氨酸的新品种植物。本发明就是鉴于上述的问题而形成的，其目的在于，提供功能改变成即使细胞内的色氨酸浓度上升，酶活性也不会降低的稻邻氨基苯甲酸合成酶和编码该酶的新型改良基因，实现含有高浓度色氨酸的新品种植物。本发明人为了解决上述问题，进行了积极的研究，其结果是，通过在稻邻氨基苯曱酸合成酶基因OASA2中导入变异，创建出对色氨酸产生的反馈抑制具有抗性的蛋白质。进而，发明人通过在上述野生型稻邻氨基苯曱酸合成酶基因OASA2中导入多个变异，使其进行组合，成功地创建出对色氨酸产生的反馈抑制具有抗性，并且与野生型稻邻氨基苯甲酸合成酶具有同等程度或以上的酶活性的蛋白质，从而完成本发明。也就是说，本发明中涉及的多肽是在序列号1中所示的氨基酸序列的第126位、第367位或第369位中的至少一个中具有变异的多肽，其特征在于，对色氨酸生物合成途径中色氨酸产生的反馈抑制具有抗性。进而，优选除了上述变异之外，还在序列号1中所示的氨基酸序列的第351位、第522位或第530位中的至少一个中具有变异的多肽，并且与野生型稻邻氨基苯甲酸合成酶相比具有至少0.7倍以上的酶活性的多肽。对色氨酸产生的反馈抑制具有抗性并且与野生型稻邻氨基苯甲酸合成酶相比具有至少0.7倍以上的酶活性的多肽，即使细胞内的色氨酸浓度上升也可以合成色氨酸，表达该多肽的植物作为含有高浓度色氨酸的营养价值高的植物是有用的。优选的是，上述序列号1中所示的氨基酸序列的第126位的变异是将丝氨酸取代为苯丙氨酸的变异，上述序列号1中所示的氨基Sl/f列的第367位的变异是将酪氨酸取代为丙氨酸或异亮氨酸的变异，上述序列号1中所示的氨基酸序列的第369位的变异是将丙氨酸取代为亮氨酸的变异。并且，优选的是，上述序列号1中所示的氨基酸序列的第351位的变异为将天冬酰胺取代为天冬氨酸的变异，上述序列号1中所示的氨基酸序列的第522位的变异为将甘氨酸取代为酪氨酸的变异，上述序列号1中所示的氨基酸序列的第530位的变异为将亮氨酸取代为丙氨酸或天冬氨酸的变异。通过上述例举的氨基酸取代，可以实现对色氨酸产生的反馈抑制具有抗性的变异型稻邻氨基苯甲酸合成酶、或对色氨酸产生的反馈抑制具有抗性并且与野生型稻邻氨基苯曱酸合成酶相比，具有至少0.7倍以上的酶活性的变异型稻邻氨基苯甲酸合成酶。作为上述变异型稻邻氨基苯曱酸合成酶，可以例举序列号2至7和序列号29至32的任一项中所示的氨基酸序列构成的多肽、或序列号2至7和序列号29至32的任一项中所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1或多个氨基酸的氨基酸序列构成的多肽。由于具有这些氨基酸序列，可以实现对色氨酸产生的反馈抑制具有抗性的变异型稻邻氨基苯甲酸合成酶、或对色氨酸产生的反馈抑制具有抗性并且与野生型稻邻氨基苯甲酸合成酶相比，具有至少0.7倍以上的酶活性的变异型稻邻氨基苯甲酸合成酶。而且，本发明中涉及的多肽是在邻氨基苯曱酸合成酶的色氨酸结合区域具有变异的多肽，其特征在于，在序列号26中所示的氨基酸序列的第5位具有变异，且对在色氨酸生物合成途径由色氨酸产生的反馈抑制具有抗性。优选的是，上述序列号26中所示的氨基酸序列的第5位的变异为将酪氨酸取代为丙氨酸或异亮氨酸的变异。对色氨酸所产生的反馈抑制具有抗性的多肽，即使细胞内的色氨酸浓度上升，也可以合成色氨酸，表达该多肽的植物作为含有高浓度色氨酸的营养价值高的植物是有用的。本发明中涉及的多核苷酸是编码上述本发明中涉及的多肽的多核苷酸。而且，本发明中涉及的多核苷酸优选序列号9至14和序列号33至36的任一项中所示的石咸基序列构成的多核苷酸、或与由与序列号9至14和序列号33至36的任一项中所示的石咸基序列构成的多核苷酸相互补的碱基序列所构成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸。通过在细胞内导入该多核香酸，可以制备能够在细胞内表达上述本发明中涉及的多肽的转化体。本发明中涉及的转化体选择用标记基因是上述本发明中涉及的多核苷酸构成的标记基因。本发明中涉及的多核苷酸所编码的多肽由于基于表达其的细胞对色氨酸类似化合物的抗性，因此可以利用其作为用于选择表达对该色氨酸类似化合物的抗性的转化细胞的标记基因。本发明中涉及的重组表达载体是上述本发明中涉及的多核苷酸构成的重组表达载体。该重组表达载体不仅可以利用本发明中涉及的多核苷酸作为用于导入于细胞的重组表达载体，还可以在使用发明中涉及的多核苷酸作为选择标记时，作为用于在细胞内导入其它基因的重组表达载体来使用。本发明中涉及的转化体是，导入了上述本发明中涉及的多核苷酸或上述本发明中涉及的重组表达载体，并且表达对色氨酸生物合成途径中色氨酸产生的反馈抑制具有抗性的多肽的转化体。转化体优选为植物细胞或植物体。表达对色氨酸产生的反馈抑制具有抗性的多肽的转化植物作为含有高浓度色氨酸的高营养价值的植物是有用的。而且，本发明还包括从上述转化植物中获得的种子。本发明中涉及的转化细胞的选择方法是通过在细胞中导入本发明中涉及的标记基因或本发明中涉及的重组表达载体，以使细胞产生对抑制细胞增殖的色氨酸类似化合物的抗性，并且选择对表达出色氨酸类似化合物抗性的细胞的选择方法。通过使用该基因作为选择标记，消除了可以在稻等单子叶植物中利用的标记的种类受限制等问题。而且，通过使用该基因解决了目前对于在细胞中导入多个基因时可以使用的选择标记的种类受限制等问题。也就是说，除了对作为常规的选择标记使用的潮霉素等抗生素的抗性等之外，可以根据对色氨酸类似化合物、例如5-甲基色氨酸的抗性选择导入了多个目的DNA的细胞。进而，由于该标记基因为源于稻的基因，因此希望稻的转化体中编码该基因的蛋白质是低抗原性的。本发明中涉及的转化试剂盒的特征在于，至少含有本发明中涉及的多核苷酸，或本发明中涉及的重组表达载体。如果使用该转化试剂盒，可以简便且有效地获得表达本发明中涉及的多肽的转化体。本发明中涉及的筛选法是筛选只与本发明中涉及的多肽和野生型稻邻氨基苯曱酸合成酶中的任意一个相结合的物质的方法，其特征在于，包括筛选与本发明中涉及的多肽相结合的物质的步骤，和篩选与野生型稻邻氨基苯甲s臾合成酶相结合的物质的步骤，和比较上述两个步骤的结果的步骤。通过该筛选方法，可以筛选与色氨酸生物合成途径中色氨酸产生的反馈抑制相关的物质，存在着与制备具有更强反馈抑制力的抗性的变异型稻邻氨基苯甲酸合成酶相关的可能性。选方法的试剂盒，其特征在于，至少含有本发明中涉及的多肽中的1个和野生型稻邻氨基苯甲酸合成酶。如果使用该篩选试剂盒，可以简便且有效地实施本发明中涉及的篩选方法。如上所述，本发明中涉及的多肽具有对色氨酸合成途径中色氨酸产生的反馈抑制具有抗性，并且与野生型稻邻氨基苯甲酸合成酶具有同程度或以上的酶活性。因此，即使在高浓度的色氨酸存在下，也起到能够合成色氨酸的效果。本发明中涉及的多核苷酸编码上述本发明中涉及的多肽。因此，通过在植物细胞中导入该多核香酸，起到可以制备即使在高浓度的色氨酸存在下也可以合成色氨酸的转化植物的效果。而且，本发明中涉及的转化植物起到可以作为色氨酸含量高且营养价值优异的食品和饲料来使用的效果。并且，通过制备色氨酸含量高的饲料用稻，起到可以降低家畜用饲料的成本的效果，以及有效利用水田，提高日本的伺料的自给率的效果。本发明的其它目的，特征和优点通过如下记载十分清晰，而且，本发明的优点，参照附图的以下说明也更加清晰。图l显示在用100mMNH4C1作为酰胺基提供基质的测定体系中，邻氨基苯甲酸合成酶活性的测定结果，其显示具有增高的酶活性的变异型OASA2蛋白。图2显示在用lOOmMNH4C1作为酰胺基提供基质的测定体系中，邻氨基苯曱酸合成酶活性的测定结果，其显示对色氨酸产生的反馈抑制具有抗性的变异型OASA2蛋白。图3显示野生型和变异体对色氨酸产生的反馈抑制的抗性程度。图4(A)是野生型OASA2蛋白的模式图。图4(B)是具有色氨酸合成体系的生物在色氨酸结合区域的氨基酸序列的比较图。图5是用农杆菌法，在稻愈伤组织的转化中使用的包括变异型OASA2基因(Y367A、Y367A/L530D、S126F/L530D)或野生型(wt)OASA2基因的外源基因的用于导入的重组载体模式图。具体实施方式(l)本发明中涉及的多肽本发明中涉及的多肽是在邻氨基苯甲酸合成酶的色氨酸结合区域中具有变异的多肽，可以是在序列号26中所示的氨基酸序列的第5位上具有变异并且对色氨酸生物合成途径中色氨酸产生的反馈抑制具有抗性的多肽。上述序列号26中所示的氨基酸序列的第5位的变异优选为将酪氨酸取代为丙氨酸或异亮氨酸的变异。图4(A)中表示了稻邻氨基苯甲酸合成酶基因OASA2(以下，也称为"OASA2基因"。)所编码的稻邻氨基苯曱酸合成酶(以下，也称为"OASA2蛋白"或"野生型OASA2蛋白")的模式图。图4(A)中的数字表示氨基酸的位置。cTP表示叶绿体移行信号，I、II和III表示色氨酸结合区域的氨基酸残基区域。而且，图4(B)中表示具有各种色氨酸合成体系的生物的色氨酸结合区域I、II和III的氨基酸序列的比较。图4(B)中的Osl表示稻OASAl(登录号AB022602)、Os2表示稻OASA2(登录号AB022603)、Atl表示拟南芥(Arabidopsis)ASA1(登录号M92353)、At2表示拟南芥(Arabidopsis)ASA2(登录号M92354)、Ss表示嗜热性古细菌(Sulfolobussolfataricus)TrpE(登录号1QDL_A)、St表示沙门氏菌(Salmonellatryphimurium)TrpE(登录号1I1Q_A)、Sm表示沙雷氏菌(Serratiamarcescens)TrpE(登录号117Q一A)。根据图4(A)和图4(B)的清楚所示，序列号26中所示的氨基酸序列(NPSPYM)在色氨酸结合区域II中，在例示的所有的生物中是保守的。因此认为这些序列在色氨酸结合区域中起非常重要的作用。作为具有这种保守的氨基酸序列的生物种类，除了图4(B)中例示的生物种以夕卜，可以例举长春花(Catharanthusroseus)a亚基(登录号CAC29060)、芸香(Rutagraveolens)ASa1(登录号L34343)、芸香(Rutagraveolens)ASa2(登录号L34344)、烟草(tobacco)ASA2(登录号T01990)、酵母(Saccharomycescerevisiae)TRP2(登录号X68327)、大肠杆菌(Escherichiacoli)TrpE(登录号V0036S)、枯草杆菌(Bacillussubtilis)TrpE(登录号P03963)，但并不限于此。上述序列号26中所示的氨基酸序列相当于，例如序列号1中所示的稻邻氨基苯曱酸合成酶基因OASA2所编码的野生型OASA2蛋白的氨基酸序列中第363位~第367位。而且，通过将该序列号26中所示的保守的氨基S吏序列中的酪氨酸取代为其它氨基酸，优选丙氨酸或异亮氨酸，可以获得对色氨酸产生的反馈抑制的抗性。本发明中涉及的多肽是在序列号1中所示的氨基酸序列的第126位、第367位或第369位的至少1个中具有变异的多肽，可以是对色氨酸生物合成途径中色氨酸产生的反馈抑制具有抗性的多肽。上述序列号1中所示的氨基酸序列构成的多肽是稻邻氨基苯甲酸合成酶基因OASA2编码的野生型稻邻氨基苯曱酸合成酶。也就是说，本发明中涉及的多肽可以是稻邻氨基苯曱酸合成酶基因OASA2(OASA2基因)所编码的野生型稻邻氨基苯甲酸合成酶(野生型OASA2蛋白)的第126位、第367位或第369位中的至少一个中具有变异，并且对色氨酸产生的反馈抑制具有抗性多肽。变异的类型没有特别的限定，例如可以是氨基酸的取代、缺失、添加等。并且，为了说明的方便，无论变异的位置、种类、数量等，将具有变异的OASA2蛋白称为"变异型OASA2蛋白"。在植物体中的色氨酸的生物合成途径中，由分支酸生成邻氨基苯曱酸，再由邻氨基苯曱酸通过6个阶段的酶促反应经过巧l哚生成色氨酸(参照非专利文献l)。邻氨基苯甲酸合成酶在上述途径中催化由分支酸向邻氨基苯甲酸的生成。而且，邻氨基苯甲酸合成酶受最终生成物色氨酸的反馈抑制，伴随细胞中的色氨酸浓度上升，酶活性降低。因此，如果细胞中的色氨酸积累到一定量，将不再有色氨酸的合成。本发明中涉及的多肽由于对如上所述色氨酸产生的反馈抑制具有抗性，即使细胞中的色氨酸浓度上升，也可以合成色氨酸，因此可以制备色氨酸含量高的植物体。测定对色氨酸产生的反馈抑制的抗性，例如，在体外酶活性测定体系中测定野生型OASA2蛋白的酶活性，以不添加色氨酸时的酶活性作为100%，可以基于存在色氨酸时的酶活性的比率(百分比)测定对色氨酸产生的反馈抑制的抗性。更具体的是，例如，如图3所示，以野生型OASA2蛋白和变异型OASA2蛋白的各个不添加色氨酸时的酶活性作为100%,在比较色氨酸添加时的酶活性的比率(百分比)时，如果超过了野生型OASA2蛋白的色氨酸添加时的酶活性的比率(百分比)，就可以说对色氨酸产生的反馈抑制具有抗性。以何种程度超过野生型OASA2蛋白的色氨酸添加时的酶活性的比率(百分比)，没有特别限定，^f旦优选至少2倍以上，更优选至少3倍以上，特别优选至少4倍以上，最优选至少5倍以上。更具体的是，例如，在使用下文的实施例3(2)(酶活性测定l)所示的活性测定体系测定酶活性时，以不添加色氨酸时的酶活性(邻氨基苯甲酸合成量)作为100%,添加100pM的色氨酸时的酶活性(邻氨基苯甲酸合成量)优选为残留20%以上者，更优选残留30%以上者，尤为优选残留40%以上者，最优选残留50%以上者。只要满足对上述反馈抑制的抗性的条件，OASA2蛋白的第126位取代丝氨酸的氨基酸没有特别的限定，但优选为苯丙氨酸。具体优选的是，序列号29中所示的氨基酸序列构成的多肽(第126位的丝氨酸取代为苯丙氨酸代)，或序列号29中所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的，并且对色氨酸产生的反馈抑制具有抗性的多肽。只要满足对上述反馈抑制的抗性的条件，0ASA2蛋白的第367位取代酪氨酸的氨基酸，没有特别的限定，但优选为丙氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸，更优选丙氨酸、异亮氨酸。具体优选的是，序列号2中所示的氨基酸序列构成的多肽(第367位的酪氨酸被取代为丙氨酸)，以及序列号3中所示的氨基酸序列构成的多肽(第367位的酪氨酸被取代为异亮氨酸)、或在序列号2或3中所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了l个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的，并且对色氨酸产生的反^t抑制具有抗性的多肽。只要满足对上述反馈抑制的抗性的条件，OASA2蛋白的第369位取代丙氨酸的氨基酸没有特别的限定，但优选为亮氨酸。具体优选的是，序列号30中所示的氨基酸序列构成的多肽(第369位的丙氨酸取代为亮氨酸)、或在序列号30中所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1或多个氨基酸的氨基酸序列构成的，并且对色氨酸产生的反馈抑制具有抗性的多肽。作为本发明中涉及的多肽，除了在上述OASA2蛋白的第126位、第367位或第369位中的至少一个中的变异外，在第351位、第522位或第530位中的至少一个中的具有变异的多肽也是优选的。本发明人证实，与野生型OASA2蛋白的酶活性相比，具有组合了上述第351位、第522位、第530位中的任意1个或2个以上变异的变异型OASA2蛋白的酶活性有提高(参照图1)。通过将酶活性提高的变异和产生对色氨酸产生的反馈抑制的抗性的变异组合在一起，可以获得对色氨酸产生的反馈抑制具有抗性，并且酶活性等同野生型OASA2蛋白或更高的变异型OASA2蛋白。这其中所谓的酶活性，可以是指，例如，下文的实施例3(2)(酶活性测定l)中所示的活性测定体系测定的邻氨基苯甲酸合成量。但是，用于测定酶活性的方法不限于此，可以是能测定邻氨基苯曱酸合成酶活性的公知的酶活性测定方法或其改良方法。而且，所谓酶活性等同野生型OASA2蛋白或更高，优选是在例如在体外酶活性测定体系(不添加色氨酸)中，变异型OASA2蛋白的酶活性是野生型OASA2蛋白的酶活性的至少0.7倍以上，更优选至少0.8倍以上，尤为优选至少0.9倍以上，最优选至少l倍以上。更具体地优选为，例如，在使用下文的实施例3(2)(酶活性测定l)中所述的活性测定体系(不添加色氨酸)测定酶活性时，变异型OASA2蛋白的邻氨基苯甲酸合成量为野生型OASA2蛋白的邻氨基苯甲酸合成量的至少0.7倍以上，更优选为至少0.8倍以上，尤为优选至少0.9倍以上，最优选至少1倍以上。OASA2蛋白的第351位为天冬酰胺，第522位为甘氨酸，第530位为亮氨酸。分别取代这些氨基酸的氨基酸没有特别的限定，不论变异单独或组合出现，只要所述变异与第126位、第367位或第369位中的至少一个变异一起导致对色氨酸产生的反馈抑制具有抗性，并且具有野生型OASA2蛋白的至少0.7倍的酶活性。取代第351位的天冬酰胺的氨基酸优选为天冬氨酸，取代第522位的甘氨酸的氨基酸优选为酪氨酸。而且，取代第530位的亮氨酸的氨基酸优选为丙氨酸、天冬氨酸，更优选为天冬氨酸。具体地，具有以下所述变异的组合的多肽是优选的。i)第367位的酪氨酸被取代为丙氨酸，第530位的亮氨酸被取代为天冬氨酸的多肽(序列号4)。ii)第351位的天冬酰胺被取代为天冬氨酸，第367位的酪氨酸被取代为丙氨酸，第530位的亮氨酸被取代为天冬氨酸的多肽(序列号5)。iii)第367位的酪氨酸被取代为丙氨酸，第522位的甘氨酸被取代为酪氨酸，第530位的亮氨酸被取代为天冬氨酸的多肽(序列号6)。iv)第367位的酪氨酸被取代为异亮氨酸，第522位的甘氨酸被取代为酪氨酸，第530位的亮氨酸被取代为天冬氨酸的多肽(序列号7)。v)第369位的丙氨酸被取代为亮氨酸的多肽(序列号30)。vi)第126位的丝氨酸被取代为苯丙氨酸，第530位的亮氨酸被取代为天冬氨酸的多肽(序列号31)。vii)第369位的丙氨酸被取代为亮氨酸，第530位的亮氨酸被取代为天冬氨酸的多肽(序列号32)。上述这些多肽中，最优选的是具有vi)所示的变异的组合的多肽。这是因为，如下文实施例所示，在稻愈伤组织中导入编码上述多肽的基因，可以确认游离色氨酸含量增加到400倍左右。也就是说，本发明中涉及的多肽优选为序列号4至7和序列号30至32的任一项中所示的氨基酸序列构成的多肽、或序列号4至7和序列号30至32的任一项中所示的氨基酸序列中，缺失、取代或添加了l个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的多肽，所述多肽对色氨酸产生的反馈抑制具有抗性并且具有野生型OASA2蛋白的至少0.7倍的酶活性的多肽。上述所谓"缺失、取代或添加了l个或多个氨基酸"是指一定数目(例如20个以下，优选10个以下，更优选7个以下，更优选5个以下，特别优选3个以下)的氨基酸的缺失、取代或添加，通过位点特异性突变诱导法等公知的变异多肽制备方法可以获得这些数目的氨基酸的取代、缺失、或添加。这种变异多肽不限于应用公知的变异多肽制备方法人工导入变异的多肽，也可以是分离纯化于天然存在的近似的变异多肽。而且，本发明中涉及的多肽可以是由氨基酸进行了肽结合形成的多肽，但不限于此，可以是含有非多肽结构的多肽。这种非多肽结构，可以是例如，糖链和类异戊二烯基等，但不特别限定于此。而且，本发明中涉及的多肽可以是包括附加多肽的多肽。作为这种附加多肽的情况，可以列举出，例如、由His或Myc、Flag等标识表位作为附加多肽的情况。而且，本发明中涉及的多肽可以由被转入宿主细胞的本发明所涉及的多核苷酸(编码本发明中涉及的多肽的多核苷酸)编码在细胞内被表达，可选择地，本发明中涉及的多肽也可以分离纯化自细胞、组织。而且，通过在上述宿主细胞中的表达条件，本发明中涉及的多肽可以是与其它多肽相连的融合蛋白质。而且，本发明中涉及的多肽也可以是化学合成的。对本发明中涉及的多肽的获得方法(生产方法)没有特别的限定，但是由于本发明中涉及的多肽是在野生型OASA2蛋白中导入了l个或多个变异的多肽，因此制备本发明涉及的多肽优选为首先在OASA2基因的碱基序列中人工导入变异基因，然后使由该变异基因编码的多肽表达。可通过公知的方法在碱基序列中导入变异，可以例举在下文的实施例中，发明人使用的Kunkel法或利用PCR在碱基序列中导入变异的方法等。而且，还可以使用市售的试剂盒(例如、Mutan-K、Mutan-SuperExpressKm、LA—PCRinvitromutagenesisKit(i匀为TaKaRaBio公司制备)等)。这样一来，通过在适当的表达载体中插入人工导入了变异的OASA2基因，导入适当的宿主细胞中在宿主内翻译而获得的产物(多肽)，可以获得本发明中涉及的多肽。而且，还可以使用如在下文的实施例中发明人所使用的小麦胚芽无细胞系统等公知的无细胞蛋白质合成体系获得导入了上述变异的OASA2基因的产物(多肽)。本的说明。(2)本发明中涉及的多核苷酸本发明中涉及的多核苷酸可以是编码上述本发明中涉及的多肽的多核苷酸。对于本发明中涉及的多肽，由于上述(l)中已详细地说明，这里就省略说明，但是，例如，具体可以是编码以下的〔1〕和〔2〕中记载的多肽的多核苷酸。〔1〕在序列号1中所示的氨基酸序列的第126位、第367位或第369位中的至少l个位置上具有变异，并且对色氨酸生物合成途径中色氨酸产生的反馈抑制具有抗性的多肽。〔2〕除了上述〔1〕的变异之外，在序列号l中所示的氨基酸序列的第351位、第522位或第530位的至少1个位置上具有变异，并且对色氨酸生物合成途径中色氨酸产生的反馈抑制具有抗性，且与野生型稻邻氨基苯甲酸合成酶相比具有至少0.7倍以上的酶活性的多肽。例如，作为序列号2中所示的氨基酸序列，即编码OASA2蛋白的氨基酸序列的第367位酪氨酸被取代为丙氨酸的多肽的多核苷酸，可碱基序歹'J)构成的多核苷酸的第1099、1100和1101位的碱基序列(tac:酪氨酸)被变异为对应于丙氨酸的密码子，即gct、gcc、gca或gcg中的任一个的多核苷酸。而且，1099~1101位的碱基以外的石威基序列也可以不与序列号8中所示的碱基序列相同，例如可以是具有编码的氨基酸没有变异的碱基取代的多核香酸。对于编码具有上述例示以外的氨基酸变异的多肽的多核苷酸，也是同样，可以是序列号8中所示的碱基序列中与变异的氨基酸对应的位置的3个碱基被取代成对应于被取代的氨基酸的密码子的碱基的多核苷酸，或具有该碱基的变异和在其之外的碱基序列中氨基酸没有变异的碱基取代的多核苷酸。作为本发明中涉及的多核苷酸，优选编码以下的〔3〕和〔4〕中记载的多肽的多核苷酸。〔3〕在序列号2、3、29或30中所示的氨基酸序列构成的多肽，或序列号2、3、29或30中所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了l个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的，并且对色氨酸产生的反馈抑制具有抗性的多肽。〔4〕在序列号4至7和序列号30至32的任一项中所示的氨基酸序列构成的多肽、或序列号4至7和序列号30至32的任一项中所示的氨基酸序列中缺失、取代或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列构成的，并且对色氨酸产生的反馈抑制具有抗性，且具有野生型OASA2蛋白的0.7倍以上的酶活性的多肽。也就是说，可以是编码序列号2~7和序列号29~32中所示的氨基酸序列的任意一个的碱基序列构成的多核香酸，具体的碱基序列没有特别的限定。但是，当然优选序列号8中所示的碱基序列、也就是说与OASA2基因的开放阅读框区域的碱基序列构成的多核苷酸的同源性高的多核苷酸。作为同源性，可以是例如、具有至少90%的同一性、优选至少95%的同一性、最优选至少97%的同一性。作为本发明中涉及的多核苷酸，可以例举序列号9至14和序列号33至36的任一项中所示的碱基序列构成的多核苷酸、或与序列号9至14和序列号33至36的任一项中所示的碱基序列构成的多核苷酸的互补的碱基序列构成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核香酸。但是，不限于此。序列号9至14和序列号33至36中所示的碱基序列构成的多核苷酸是分别编码序列号2至7和序列号29至32中所示的氨基酸序列构成的多肽的碱基序列构成的多核苷酸。序列号9至14和序列号33至36中所示的碱基序列构成的多核苷酸是发明人用下文的实施例中记载的方法制备的多核苷酸。上述所称"严谨条件"是指只在序列间存在至少90%的同一性、优选至少95%的同一性、最优选至少97%的同一性时发生杂交，例如、于60。C2xSSC清洗条件下结合。上述杂交可以用"MolecularCloning(分子克隆)(第三版)(J.Sambrook和D.W.Russell，ColdSpringHarborLaboratoryPress(冷泉港实验室出版社)，2001)中记载的方法等以往公知的方法进行。通常、温度越高，盐浓度越低，严谨度越高。本发明中涉及的多核苷酸中包括DNA和RNA,可以是单链，也可以是双链。而且，可以是包括非翻译区域(UTR)的序列和载体序列(包括表达载体序列)等序列的序列。本发明中涉及的多核苷酸的获得方法(生产方法)没有特别的限定，但可以例举，例如、在OASA2基因的碱基序列中人工导入变异的方法。作为在碱基序列中导入变异的公知方法，可以例举Kunkel法和利用PCR在碱基序列中导入变异的方法等。而且还可以使用市售的试剂盒(例长口、Mutan-K、Mutan國SuperExpressKm、LA-PCRinvitromutagenesisKit(均由TaKaRaBio公司制)等)。本发明中涉及的多核苷(3)转化用标记基因和转化细胞的选择方法本发明中涉及的多核苷酸可以用作转化用标记基因。也就是说，本发明中涉及的转化体选择用标记基因可以是上述(2)中记载的本发明中涉及的多核苷酸构成的标记基因。导入了本发明中涉及的多核香酸的细胞由于形成色氨酸抗性，通过在培养基中添加色氨酸类似化合物，可以只选择导入了该多核香酸的细胞。可以作为选择用药剂使用的抑制细胞的增殖的色氨酸类似化合物的例子有，例如，5-甲基色氨酸(5MT)、4-曱基色氨酸(4MT)、6-甲基色氨酸(6MT)、7-甲基色氨酸(7MT)、6-曱基邻氨基苯曱酸(6MA)、5-曱基邻氨基苯甲酸(5MA)、3-曱基邻氨基苯曱酸(3MA)、5-氟代邻氨基苯曱酸(5FA)、6-氟代邻氨基苯甲酸(6FA)等。具体的是，为了利用本发明中涉及的多核苷酸作为转化用标记基因，例如，构建整合了该多核香酸的表达载体，将该表达载体导入目的细胞。由于导入了该表达载体，表达编码由本发明中涉及的多核苷酸编码的多肽的细胞获得色氨酸抗性，因此即使在添加了上述示例的选择用药剂的培养基中也可以增殖；另一方面，没有导入该表达载体的细胞和不表达本发明中涉及的多核苷酸所编码的多肽的细胞的增殖受到抑制。因此，可以只选择导入了该表达载体，表达由本发明中涉及的多核苷酸所编码的多肽的转化细胞。上述的例子中，本发明中涉及的多核苷酸可以作为在转化细胞中表达的基因和标记基因两者使用，本发明中涉及的多核苷酸也可以只作为标记基因使用。而且，例如，通过使用植物的愈伤组织细胞特异的转录启动子，还可以控制作为选择标记的本发明中涉及的多核苷酸的表达时间。此时，可以再构建另一个表达载体，在所述表达载体中插入了要在目的细胞内表达的蛋白质的编码基因，该表达载体用于转化靶细胞。而且，不构建整合了本发明中涉及的多核苷酸的表达载体，也可以单独在目的细胞中导入本发明中涉及的多核苷酸。通过使用本发明中涉及的多核苷酸作为选择标记，消除了可以在稻等单子叶植物中应用的标记的种类受限制等问题。而且，针对目前在细胞中导入多个基因时可以使用的选择标记的种类受限制等问题，通过使用该基因可以解决。也就是说，除了作为常规的选择标记使用的潮霉素等抗生素的抗性之外，可以根据对色氨酸类似化合物，例如5-曱基色氨酸的抗性选择导入了多个目的DNA的细胞。进而，由于该标记基因源于稻，因此希望稻的转化体中编码该基因的蛋白是低抗原性的。并且，在本发明中，还包括通过在细胞中导入上述本发明中涉及的标记基因或以下说明的重组表达载体，赋予细胞对抑制细胞增殖的色氨酸类似化合物的抗性，而且选择表达对该色氨酸类似化合物的抗性的细胞的转化细胞的选择方法。(4)重组表达载体和转化试剂盒本发明中涉及的重组表达载体如果是含有上述(2)中记载的本发明中涉及的多核苷酸的表达载体，就没有特别的限定。例如，可以列举插入了cDNA的重组表达载体。在重组表达载体的制备中，可以使用质粒、噬菌体、或柯斯质粒等，没有特别的限定。而且，可以使用7>知的方法进4于制备。载体的具体的种类没有特别的限定，可以适当选择在宿主细胞中能够表达的载体。也就是说，根据宿主细胞的种类，选择适当的启动子序列以使基因确实地表达，可以使用在各种质粒中整合了本发明中涉及的多核苷酸和所述启动子的载体作为表达载体。当然可以使用该重组表达载体表达本发明中涉及的多肽，但也可以利用本发明中涉及的多核苷酸作为标记基因，通过整合其它基因作为用于使这些基因编码的蛋白质表达的重组表达载体。为了确认本发明中涉及的多核苷酸是否导入于宿主细胞中，而且在宿主细胞中是否确实地表达，可以4吏用各种标记。使用赋予细胞抗生素例如潮霉素抗性的药物抗性基因作为标记，在宿主细胞中导入作为表达载体的含有该标记和本发明中涉及的多核苷酸的质粒。由此可以根据标记基因的表达确认本发明的基因的导入。上述宿主细胞如果是具有色氨酸合成体系的细胞、生物，就没有特别的限定，可以适当使用以往公知的各种细胞。具体可以例举，例如、大肠杆菌(Escherichiacoli)等细菌、酵母(出芽酵母Saccharomycescerevisiae、分裂酵母Schizosaccharomycespombe)等，但没有特另'J的限定。在宿主细胞中导入上述表达载体的方法，即转化方法，没有特别的限定，例如，电穿孔法(electroporation法)、磷酸钓法、原生质体法、醋酸锂法等以往公知的方法。本发明中涉及的转化试剂盒可以是含有上述(2)中记载的本发明中涉及的多核苷酸或该本发明中涉及的重组表达载体的至少一个的试剂盒。对于其它的具体的构成，没有特别的限定，可以适当选择需要的试剂和器具等构成试剂盒。通过使用转化期试剂盒，可以简便且有效地获得转化细胞。。)转化体本发明中涉及的转化体如果是导入了上述(2)中记载的本发明中涉及的多核苷酸或上述(4)中记载的重组表达载体，并且，表达对色氨酸生物合成途径中色氨酸产生的反馈抑制具有抗性的多肽的转化体，就没有特别的限定。这里所称的"转化体"，不仅包纟舌细胞、组织、器官，还包括生物个体。转化体的制备方法(生产方法)没有特别的限定，可以列举，例如，通过在宿主细胞中导入上述重组表达载体进行转化的方法。而且，如果是具有色氨酸合成系的细胞、生物，作为转化对象的生物没有特别的限定，可以例举上述(4)中作为宿主细胞的例示的各种微生物等。本发明中涉及的转化体优选植物细胞或植物体。这种转化植物作为色氨酸的含量高，营养价值高的食品原料和饲料，具有高利用价值。可以在植物体的转化中使用的重组表达载体如果可以是使插入基因在该植物细胞内表达的重组表达载体，没有特别的限制。尤其是，在向植物体导入载体的方法为采用农杆菌的方法时，优选使用pBI系等二元载体。作为二元载体，具体可以例举例如、pBIG、pBIN19、pBI101、pBI121、pBI221等。而且，优选具有在植物体内可以使基因表达的启动子的载体。作为启动子，可以适当使用公知的启动子，具体可以列举，例如、花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)、泛素(Ubiquitin)启动子和肌动蛋白启动子。而且、可以使用各种形态的植物细胞、例如、悬浮培养细胞、原生质体、叶切片、愈伤组织等。在向植物细胞导入重组表达载体时，可以使用聚乙二醇法、电穿孔法(electroporation法)、农杆菌介导的方法、基因枪法等公知的各种方法。而且，可以根据植物细胞的种类用公知的方法进行由转化细胞向植物体的再生。如果已经获得了在基因组内导入了本发明中涉及的多核苷酸的转化植物体，在由该植物体获得的种子中也导入了该多核苷酸。例如、在被本发明中涉及的多核苷酸转化的稻等谷物中，可以获得色氨酸含量高的谷物。本发明还包括由转化植物获得的种子。(6)筛选方法和筛选试剂盒本发明中涉及的筛选方法为筛选只与(l)中记载的本发明中涉及的多肽(变异型OASA2蛋白)和野生型稻邻氨基苯甲酸合成酶(OASA2蛋白)中的任一者的物质的方法，并且可以包括篩选与变异型OASA2蛋白相结合的物质的步骤，和篩选与野生型OASA2蛋白结合的物质的步骤，和比较上述两步骤的结果的步骤。上述本发明中涉及的多肽、即变异型OASA2蛋白，由于对色氨酸生物合成途径中色氨酸产生的反馈抑制具有抗性，因此我们认为上述只与变异型OASA2蛋白和野生型OASA2蛋白中的任一者结合的物质非常可能是在色氨酸生物合成途径中涉及反馈抑制的信号物质。如果通过该筛选方法发现这种物质，则有望促进了解反馈抑制的机制，有助于开发对反馈抑制的抗性更强的变异型OASA2蛋白。而且，本发明中涉及的篩选试剂盒为用于实施上述筛选方法的试剂盒，可以是至少含有l种本发明中涉及的多肽和野生型稻邻氨基苯甲酸合成酶的试剂盒。对于其它具体的构成，没有特别的限定，可以适当选择需要的试剂和器具等构成试剂盒。通过使用该转化期试剂盒，可以简便且有效地实施上述本发明中涉及的筛选方法。本发明不限于所描述的实施方式，在权利要求中公开的范围内，可以进行各种改变，在不同的实施方式中，通过适当组合各个公开的技术手段获得的实施方式，也包括在本发明的技术范围内。实施例实施例l:向稻邻氨基苯曱酸合成酶基因0ASA2中导入变异<目的基因向克隆载体的插入〉在克隆载体pBluescriptSK+(Stratagene公司制)的多克隆位点的EcoRI位点插入稻邻氨基苯曱酸合成酶基因OASA2(登录号AB022603),构建pBS-OASA2。并且，按由多克隆位点的限制性内切酶位点KpnI向SacI方向插入基因。<变异导入用引物>用Kunkel法在编码目的蛋白质的基因中导入变异时，设定在要导入变异的位置导入正义(或反义)的变异用多核苷酸。用PCR在编码目的蛋白质的基因中导入变异时，在要导入变异的位置设计使用2条引物、即正义和反义的多核苷酸。因此，该变异导入用引物中的一条，可以作为在上述Kunkel法中使用的变异导入用寡核苷酸使用。此时，通过在不改变基因所编码的氨基酸的适当位置导入限制性内切酶位点可以对变异导入的有无进行确认。用Kunkel法导入下述i)~vi)的变异，用PCR导入下述vii)和viii)的变异。<变异导入用引物>i)将第351位的天冬酰胺残基取代为天冬氨酸残基(N351D)将变异导入用引物设计成将第351位的天冬酰胺残基氨基酸取代为天冬氨酸残基，并且，在编码的氨基酸不改变的位置导入限制性内切酶位点(BsiWI)。变异导入用引物的石成基序列如下所述。而且，下划线表示限制性内切酶位点，小写字表示变异导入密码子。N351D-F:5'-GTTTGAGAGGCGAACGTACGCCgatCCATTTGAAGTCT-3'(序列号15)分别根据野生型OASA2的AAT(天冬酰胺，N)和CATACG的碱基序列设计引物N351D-F的第23位至第25位的gat(天冬氨酸，D)和第15位至第20位的CGTACG(BsiWI位点)。通过将AAT变成GAT将第351位的天冬酰胺残基取代成天冬氨酸残基。而且，通过使CATACG变成CGTACG,不发生氨基酸取代却导入(ACA、ACG均为苏氨酸)限制性内切酶位点(BsiWI:CGTACG)，可以使变异导入后的选择变得容易。ii)将第367位的酪氨酸残基取代为丙氨酸残基(Y367A)与上述i)相同，将变异导入引物设计为将第367位的酪氨酸残基取代为丙氨酸残基，并且，在编码的氨基酸不发生变化的位置导入限制内切性酶位点(SnaBI:TACGTA)。变异导入用引物的碱基序列如下所述。而且，下划线表示限制性内切酶位点，小写字表示变异导入密码子。Y367A-F:5'画GTGAACCCAAGTCCAgccATGGCATACGTACAGGCAAGAGGC-3'(序列号16)iii)将第367位的酪氨酸残基取代为异亮氨酸残基(Y3671)与上述i)相同，将变异导入用引物设计成将第367位的酪氨酸残基氨基酸取代为异亮氨酸残基，并且，在编码的氨基酸不改变的位置导入限制性内切酶位点(SnaBI:TACGTA)。变异导入用引物的碱基序列如下所述。而且，下划线表示限制性内切酶位点，小写字表示变异导入密码子。Y367I画F:5'-GTGAACCCAAGTCCAatcATGGCATACGTACAGGCAAGAGGC-3'(序列号17)iv)将第530位的亮氨酸残基取代为丙氨酸残基(L530A)与上述i)相同，将变异导入用引物设计成将第530位的亮氨酸残基取代为丙氨酸残基，并且，在编码的氨基酸不改变的位置导入限制性内切酶位点(NheI:GCTAGC)。变异导入用引物的石成基序列如下所述。而且，下划线表示限制性内切酶位点，小写字表示变异导入密码子。L530A-F:5'画ACGGAGACATGgctATCGCGCTAGCACTCCGCACCATT-3'(序列号18)v)将第530位的亮氨酸残基取代为天冬氨酸残基(L530D)将变异导入引物设计为将第530位的亮氨酸残基取代为天冬氨酸残基，并且，在编码的氨基酸不改变的位置导入限制性内切酶位点(Nhel:GCTAGC)。变异导入用引物的碱基序列如下所述。而且，下划线表示限制性内切酶位点，小写字表示变异导入密码子。L530D-F:5'-ACGGAGACATGgacATCGCGCTAGCACTCCGCACCATT-3'(序列号19)vi)将第522位的甘氨酸残基取代为酪氨酸残基，将第530位的亮氨酸残基取代为天冬氨酸残基(G522Y+L530D)与上述i)相同，将变异导入引物设计为将第522位的甘氨酸残基取代为酪氨酸残基，将第530位的亮氨酸残基取代为天冬氨酸残基，并且，在编码的氨基酸不改变的位置导入限制性内切酶位点(BciVI:GTATCC/GGATAC)。变异导入用引物的石咸基序列如下所述。而且，下划线表示限制性内切酶位点，小写字表示变异导入密码子。G522Y+L530D画F:5'画AGTGGCGGCCTTGGAtacATATCATTTGACGGAGACATGgatATCGCTCTTGCACT-3'(序列号20)vii)将第126位的丝氨酸残基取代为苯丙氨酸残基(S126F)将变异导入用引物设计为将第126位的丝氨酸残基取代为苯丙氨酸残基。变异导入法中，由于要通过采用PCR的方法导入变异，因此制成正义和反义的多核苷酸。变异导入用引物的碱基序列如下所述。而且，小写字表示变异导入密码子。S126F-F:5'画GCTTCCTCTTCGAGttcGTCGAGCAGGGGCC-3'(序列号37)S126F陽R:5'-GGCCCCTGCTCGACgaaCTCGAAGAGGAAGC國3'(序列号38)根据野生型OASA2的TCC(丝氨酸，S)设计引物S126F-F的第15位至第17位的ttc(苯丙氨酸，F)。通过将TCC变成TTC,将第126位的丝氨酸残基耳又代为苯丙氨酸残基。引物S126F-R为引物S126F-F的互补链。viii)将第369位的丙氨酸残基取代为亮氨酸残基(A369L)与上述i)相同，将变异导入用引物设计成将第369位的丙氨酸残基取代为亮氨酸残基。变异导入法中，由于要通过采用PCR的方法导入变异，因此制成正义和反义的多核苷酸。变异导入用引物的碱基序列如下所述。而且，小写字表示变异导入密码子。A369L-F:5'-CAAGTCCATACATGctaTATGTACAGGCAA-3'(序列号39)A369L-R:5'-TTGCCTGTACATAtagCATGTATGGACTTG-3'(序列号40)引物A369L-R为引物A369L-F的互补链。<用Kunkel法进行变异导入DNA的制备>Kunkel法按照下述参考文献l-3中记载的方法进行。参考文献l:Kunkel，T.A.(1985)Rapidandefficientsite-specificmutagenesiswithoutphenotypicselection(无表型选择的快速有效的位点净特异性诱变).ProceedingsoftheNationalAcademyofScienceoftheUSA(美国科学院院刊)，82:488-492.参考文献2:Kunkel，T.A.，Bebenek,K.和McClary，J.(1991)Efficientsite-Directedmutagenesisusinguracil-containingDNA(使用含尿嘧啶DNA的有效的定点诱变).MethodsinEnzymology(酶学方法)，204:125-139.参考文献3:MolecularCloning(分子克隆)(第三版)(J.Sambrook和D.W.Russell,ColdSpringHarborLaboratoryPress(冷泉港实验室出版社),(2001)Chapter13(第13章).例如，在将第351位的天冬酰胺残基取代为天冬氨酸残基时，以前述的pBS-OASA2载体作为模板，使用上述i)中记载的变异导入用引物，通过进行Kunkel法导入变异。上述ii)、iv)、v)、vi)中记载的使用变异导入用引物时，使用与上述相同的模板进行Kunkel法。通过以上才喿作制备N351D、Y367A、L530A、L530D、G522Y+L530D变异DNA。通过重复两次变异导入步骤制备N351D+L530A的双重变异DNA。也就是说，起初，以前述的pBS-OASA2载体作为模板，使用上述i)中记载的变异导入用引物制备N351D变异DNA。然后，以导入了N351D的变异的质粒DNA(pBS-OASA2(N351D)载体)作为模板，使用上述iv)中记载的变异导入用引物，获得了导入了两个变异的变异DNA(N351D+L530A)。同样，以导入了N351D的变异的质粒DNA(pBS-OASA2(N351D)载体)作为模板，使用上述v)中记载的变异导入用引物，获得了导入了两个变异的变异DNA(N351D+L530D)，以导入了Y367A的变异的质粒DNA(pBS-OASA2(Y367A)载体)作为模板，使用上述v)中记载的变异导入用引物，获得了导入了两个变异的变异DNA(Y367A+L530D)。通过以含有上述双重变异DNA的质粒DNA作为模板进行Kunkel法制备三重变异DNA。也就是说，以预先导入了N351D+L530A的变异的质粒DNA(pBS-OASA2(N351D+L530A)载体)作为模板、使用上述ii)中记载的变异导入用引物，获得了导入了3个变异的变异DNA(N351D+Y367A+L530A)。同样，以导入了G522Y+L530D的变异的质粒DNA(pBS-OASA2(G522Y+L530D)载体)作为模板、使用上述ii)中记载的变异导入用引物，获得了导入了3个变异的变异DNA(Y367A+G522Y+L530A)。同样，以导入了G522Y+L530D的变异的质粒DNA(pBS-OASA2(G522Y+L530D)载体)作为模板、使用上述iii)中记载的变异导入用引物，获得了导入了3个变异的变异DNA(Y3671+G522Y+L530A)。<用RCR法制备变异导入用DNA〉按照下述参考文献中记载的方法进行通过PCR法进行的变异导入法。HiguchiR,KrummelB,SaikiRK(1988)AgeneralmethodofinvitropreparationandspecificmutagenesisofDNAfragments:studyofproteinandDNAinteractions(DNA片l殳的体外制备和特异突变的一4殳方法蛋白质和DNA相互作用的研究).NucleicAcidsRes(核苷酸研究)16:7351-7367通过将OASA2基因分成5，侧区域和3，侧区域使得在变异导入用的引物区域重叠进行PCR。例如，在使用用于将上述vii)中记载的第126位的丝氨酸取代为苯丙氨酸的变异导入用引物时，5'侧区域以pBS-OASA2载体作为模板，通过组合克隆用正义引物(5'-AAAACTAGTTGGAGTCCATCGCCGCCGCCACG-3':序歹。号41,下划线表示限制性内切酶Spel位点)和引物S126F-R进行PCR,3，区域以pBS-OASA2载体作为模板，通过组合引物S126F-F和克隆用反义亏I物(5'-AAAGTCGACTTGAGAGAGACTCTATTCCTTGTC-3':序列号42,下划线表示限制性内切酶SalI位点)进行PCR。在使用上述viii)中记载的变异导入用引物时，也使用与上述相同的模板，通过组合相同的引物进行PCR。在制备S126F+L530D的双重变异DNA时，使用在作为模板的pBS-0八3八2载体中用前述的Kunkel法已经导入了将OASA2的第530位的亮氨酸残基氨基酸取代为天冬氨酸残基的变异的质粒DNA。因此，通过使用上述vii)中记载的变异导入用引物(S126F-F和S126F-R)进行PCR,获得了导入了将OASA2的第126位的丝氨酸残基取代为苯丙氨酸残基，将第530位的亮氨酸残基氨基酸取代为天冬氨酸残基这两个变异的变异基因。而且，引物的组合与上述相同。A369L+L530D的双重变异DNA的制备，通过使用与上述相同的模板和上述viii)中记载的变异导入用引物(A369L-F和A369L-R)进行PCR，获得了导入了将OASA2的第369位的丙氨酸残基取代为亮氨酸残基，将第530位的亮氨酸残基氨基酸取代为天冬氨酸残基的两个变异的变异基因。PCR反应的组成为，1xPyrobestbufferII(TaKaRa公司)、0.2mMdNTP、0.5juM正义和反义引物、0.025单位/julPyrobestDNA聚合酶(TaKaRa公司)、10ng模板DNA,使用PCR^应装置(宝酒造公司制，TaKaRaPCRThermalCyclerMPTP3000型)，于95。C保持2分钟后，重复进行25个98。C20秒、60。C35秒、72。C3分的反应的循环，保持在72。C10分钟后，冷却至4。C。将扩增的PCR产物(5'区域片段和3，区域片段)稀释20倍，将平均每ljal加入到PCRA应液[lxPyrobestbufferII(TaKaRa公司)、0.2mMdNTP、0.025单位/ialPyrobestDNA聚合酶(TaKaR"土)]中，使用上述PCR^应装置、于95。C保持2分钟后，重复进行25个98"20秒、60°C35秒、72。C3分的反应的循环，进行延伸反应。通过该反应，合成由克隆用正义引物至克隆用反义引物连接的DNA片段。上述反应后立即添加克隆用正义引物和克隆用反义引物使得引物的浓度分别达到0.2jaM，使用上述PCR装置，于95。C保持2分钟后，重复进行20个98。C20秒、60。C35秒、72。C3分的反应的循环、保持在72。C10分钟后，冷却至4。C。通过以上反应，扩增出由上述克隆用正义引物至克隆用反义引物连结的DNA片段，将其插入于克隆载体pBluescriptKS+(Stratagene&3)的多克隆位点的SpeI和SalI中，构建出pBS國OASA2(S126F)、pBS-OASA2(A369L)、pBS-OASA2(S126F/L530D)、pBS-OASA2(A369L/L530D)。实施例2:由小麦胚芽无细胞系统合成蛋白质(l)用Split-PCR法合成转录模板DNA<Split-PCR用模板的制备>OASA2基因为稻的核基因组上的编码基因，但是推测合成的蛋白质移行进入叶绿体，在叶绿体内行使功能。在合成的蛋白质的N末端区域存在用于向叶绿体移行的信号序列，通过除去该序列形成成熟型酶，发挥酶活性。因此，为了在小麦胚芽无细胞合成系统合成OASA2蛋白作为成熟型酶，将引物设计成除去了存在于N末端区域的49个残基构成的信号序列的形态而被合成。也就是说，在小麦胚芽无细胞合成系统中在可以Split-PCR的linker序列的下游配置ATG起始密码子，设计由OASA2基因的第148至第164位的碱基序列构成的全长为36mer的引物。而且，在插入了OASA2基因的载体(pBluescriptSK+)上，在上述正义Split-PCR用引物的互补链侧的位置设定两种Split-PCR用反义引物。按从插入DNA的位置至远处顺序作为反义Split-PCR用引物l和反义Split-PCR用引物2。Split-PCR用引物的石咸基序列如下所述。而且，下文对Split-PCR进行描述。正义Split画PCR用引物5'-CCTCTTCCAGGGCCCAATGTGCTCCGCGGGGAAGCC-3'(序列号21,下划线部分为linker序列)反义Split-PCR用引物l:5'-GGAGAAAGGCGGACAGGTAT-3'(序列号22)反义Split-PCR用引物2:5'-GGGGAAACGCCTGGTATCTT-3'(序列号23)SK+载体作为模板，使用上述正义Split-PCR用引物和反义Split-PCR用引物1进行PCR等扩增反应，可以将扩增的DNA片段作为接下来进行的Split-PCR的模板。PCR反应液的组成1xPyrobestbufferII(TaKaRa公司)、0.2mMdNTP、0.5|uM正义Split-PCR用引物和反义Split-PCR用引物1、0.025单位/n1PyrobestDNA聚合酶(TaKaRa公司)、10ng模板DNA(导入了各变异的pBS-OASA2载体)，使用PCR反应装置(宝酒造公司制、TaKaRaPCRThermalCyclerMPTP3000型)，于95。C保持2分钟后，重复进行25个98。C20秒、60。C35秒、72。C3分的反应的循环，保持在72。C10分钟后，冷却至4。C。通过以上反应，扩增出由上述正义Split-PCR用引物至反义Split-PCR用引物1连结的DNA片段，将扩增的DNA片段作为接下来进行的Split-PCR的冲模板。<转录模板DNA的合成〉为了以上述Split-PCR用模板DNA作为转录模板DNA,需要在片段的5'末端上游添加SP6RNA聚合酶的启动子和烟草花叶病毒(TMV)来源的翻译增强序列(omega序列)。为此，按照Sawasaki等人的方法(Sawasaki等人.(2002)ProcNatlAcadSciUSA(美国科学院院刊)99,14652-14657),进行Split-PCR。也就是说，将上述Split-PCR用模板DNA稀释50倍，在PCR反应液[lxEXTaqbuffer(TaKaRa公司)、0.2mMdNTP、0.025单位/|a1TaKaRaEXTaq(TaKaRa公司)、0.2jaMSP6启动子引物、lnMTMV-Omega引物、0.2pM反义Split-PCR用引物2]中添加lial,使用上述PCR反应装置、于95。C保持2分钟后，重复进行35个98。C20秒、60。C35秒、72。C3分的反应的循环，保持在72。C10分钟后，冷却至4。C。SP6启动子引物和TMV-Omega引物的石成基序列如下所示。而且，下划线表示SP6启动子序列，小写字表示两引物的重复部分。SP6启动子引物5'-GCGTAGCATTTAggtgacact-3'(序列号24)TMV-Omega引物5'國ggtgacactATAGAAGTATTTTTACAACAATTCTACAACTACCTCTTCCAGGGCCCAATG國3'(序列号25)这里，如上述SP6启动子引物和TMV-Omega引物这样，将引物分为上游侧引物和下游侧引物，将^皮:没计成与上游侧引物的3，末端和下游侧引物的5，末端的序列部分重复的引物称为Splitprimer。而且，将使用这种f1物进行的PCR^应称为Split-PCR。(2)小麦胚芽无细月包系统用的mRNA的合成使用上述(1)中获得的PCR产物作为直接模板，合成(转录)mRNA。也就是说，将上述(1)中获得的PCR产物以1/10量添加于转录反应液[80mMHEPES画KOH(pH7.8)、16mMMg(OAc)2、10mM亚精胺、10mMDTT、3mMNTP、1单位/ja1RNasinRNaseinhibitor(Promega公司)、l单位/iulSP6RNA聚合酶(Promega公司)]中。于37。C反应2小时后，进行乙醇沉淀、70%的乙醇清洗，溶解于适量的无菌水中。通过测定260nm的吸光度计算出RNA量。(3)用d、麦胚芽无细胞系统合成蛋白质按照Sawasaki等人的方法(Sawasaki等人.(2002)ProcNatlAcadSciUSA(美国科学院院刊)99,14652-14657)，以上述(3)中合成的mRNA作为模板合成蛋白质。也就是说，在装入了50jal的小麦胚芽无细胞蛋白质合成液的透析杯中添加上述mRNA(约30-35jag),将上述透析杯浸渍于每l孔装入了lml的底物液的24孔板，于26。C温育24小时。实施例3:变异型OASA2蛋白的活性测定(l)用蛋白印记法(WesternBlot)进行的OASA2蛋白的定量使用基于OASA2蛋白的氨基酸序歹'J(序列号1)的第161位~第175位的序歹U(MDHEKGKVTEQVVDD)的肽片段制作的家兔抗OASA2抗体和OASA2蛋白纯化标品，通过小麦胚芽无细胞系统定量合成的OASA2蛋白。按照Towbin等人的方法(Towbin，H.，Staehelin，T.和Gordon,J.1979.Electrophoretictransferofproteinsfrompolyacrylamidegelstonitrocellulosesheets:procedureandsomeapplications(蛋白乂人聚丙烯酰胺凝胶到硝化纤维素片的电泳转移步骤及一些应用).ProcNatlAcadSciUSA(美国科学院院刊)76:4350-4354.)进行WesternBlot分析。以用上述方法估计的OASA2蛋白量校正下文的酶活性。(2)OASA2蛋白的活性测定稻邻氨基苯曱酸合成酶的oc亚基-OASA2蛋白通过利用P亚基提供的谷氨酰胺酰胺基来源的氨由分支酸生成邻氨基苯甲酸。在生物体内，OASA2蛋白通过利用(3亚基供给的氨发挥邻氨基苯甲酸合成活性(以下，简称为"AS活性，，。)，即使从外部添加氨、例如NH4C1，也显示酶活性。OASA2蛋白的活性由于会受到公知的色氨酸产生的反馈抑制，因此需要从上述蛋白质合成反应液中除去色氨酸，而且需要将表达的蛋白质的环境改变成AS活性测定用的緩冲液成分。因此，用MicrospinG-25columns(AmershamBiosciences公司制)将蛋白质合成反应液的成分置换成緩沖液A(50mMTris國HC1,pH7.6;0.05mMEDTA;2mMMgCl2;0.05mMDTT;5%甘油)。<酶活性测定1〉在90ial的反应液(20mMTris-HCl，pH8.3;100mMNH4C1;0.5mM分支酸；10mMMgCl2)中加入2.5iLil被緩冲液置换的粗提取液，使之于32。C反应l小时。通过添加10jul1NHC1使反应停止，通过添加300iul的醋酸乙酯提取合成的邻氨基苯甲酸。用Wallacl420ARVOsx-FL(PerkinElmerLifeScienceJapan司制)于激发波长355nm/萤光(emmision)460nm处测定邻氨基苯甲酸的合成量。分析对色氨酸的反馈抑制活性时，在反应系中添加色氨酸使得终浓度达到10jaM或100iaM。结果示于图1和图2。如图l清楚所示，6种变异型OASA2蛋白(N351D、L530A、L530D、N351D/L530A、N351D/L530D和G522Y/L530D)与野生型(wt)相比，酶活性提高。而且，如图2清楚所示，7种变异型OASA2蛋白(A369L、S126F/L530D、Y367A/L530D、A369L/L530D、N351D/Y367A/L530D、Y367A/G522Y/L530D和Y367I/G522Y/L530D)在不添加色氨酸时的酶活性等同或超出野生型酶活性，并且，获得了对色氨酸反馈抑制的抗性。<酶活性测定2〉为了更详细地研究获得了对上述色氨酸反馈抑制的抗性的5种变异型OASA2蛋白的酶学性质，在使用稻邻氨基苯甲酸合成酶p亚基的反应系中分析酶活性和色氨^馈抑制。在添加了过剩量的稻邻氨基苯甲酸合成酶(3亚基的90jul反应液(20mMTris-HCl，pH8.3;5mM谷氨酰胺；0.2~0.8mM分支酸；10mMMgCl2;)中添加2.5ial被緩沖液取代的粗提取液，使之于32。C反应1小时。而且，稻邻氨基苯曱酸合成酶(3亚基的制备和通过WesternBlot法进行的合成量的定量按照Kanno等人的方法(Kannoetal.(2004)PlantMolecularBiology(植物分子生物学)54,11-22)进行。通过添加10jalINHC1使反应停止、通过添力口300nl的醋酸乙酯提取合成的邻氨基苯甲酸。用Wallacl420ARVOsx-FL(PerkinElmerLifeScienceJapan爿^司制)于激发波长355nm/萤光(emmision)460nm处测定邻氨基苯甲酸的合成量。分析对色氨酸的反馈抑制活性时，在反应系中添加色氨酸使得终浓度达到10)aM、25laM或50jaM。结果示于表1和图3。如表l清楚所示，9种变异型OASA2蛋白(S126F、Y367A、A369L、S126F/L530D、Y367A/L530D、A369L/L530D、N351D/Y367A/L530D、Y367A/G522Y/L530D和Y367I/G522Y/L530D)，除了S126F、Y367A,与野生型(wt)相比具有同等程度或超出的酶活性。更详细的是，与野生型(wt)相比，A369L的酶活性为约l倍、S126F/L530D的酶活性为约2.5倍、Y367A/L530D的酶活性为约2.2倍、A369L/L530D的酶活性为约1.8倍、Y367A/G522Y/L530D的酶活性为约1.3倍、N351D/Y367A/L530D的酶活性为约1.2倍、Y367I/G522Y/L530D的酶活性为约0.8倍。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>而且，图3为以在不添加色氨酸的野生型和各变异型OASA2蛋白酶活性作为100%，将添加各浓度的色氨酸时的酶活性与不添加色氨酸时的酶活性相比较的图。如图3清楚所示，野生型如果添加50jliM以上色氨酸，酶活性下降为不添加时的10。/。，但是9种变异型OASA2蛋白(S126F、Y367A、A369L、S126F/L530D、Y367A/L530D、A369L/L530D、N351D/Y367A/L530D、Y367A/G522Y/L530D和Y3671/G522Y/L530D)即使在添加50jaM色氨酸时也具有不添加时的300/。以上的酶活性。实施例4:使变异型0ASA2基因表达的酵母TRP2基因缺失变异抹(MATalphahis3A1leu2AOmetl5AOura3AOtrp2::KANMX)的游离色氨酸含量分析缺失了相当于0ASA2基因的TRP2基因的酵母为了生长需要色氨酸。因此，将OASA2基因导入于该缺失林中，如果可以在色氨酸非存在下生长，导入的OASA2基因就可以互补TRP2的功能。而且，使对色氨酸反馈抑制具有抗性的变异型OASA2基因在该酵母中表达，通过测定积累在生物体内中的游离色氨酸含量可以进行该基因的效果测定。为了构建表达载体，以插入了对色氨酸反馈抑制具有抗性的变异型OASA2基因(S126F、Y367A、A369L、S126F/L530D、Y367A/L530D、A369L/L530D、N351D/Y367A/L530D、Y367A/G522Y/L530D、Y367I/G522Y/L530D)和野生型(Wt)OASA2基因的pBluescript载体作为模板，使用下述引物进行PCR。如上所述，由于OASA2蛋白的N末端区域上存在叶绿体移行信号，与上述(2)中记载的"Split-PCR用引物"的设计同样，将引物设计成以除去信号序列的形式表达。而且，在正义引物中导入限制性内切酶位点KpnI(GGTACC)、在反义引物中导入限制性内切酶位点EcoRI(GAATTC),使得整合到酵母表达载体pYES2(Invitrogen公司制)的限制性内切酶位点Kpnl/EcoRI中。这些限制性内切酶位点用下划线表示。而且，pYES2载体具有URA3基因，通过半乳糖可以控制蛋白质的表达诱导。正义引物5'-AAAGGTACCATGTGCTCCGCGGGGAAGCC-3，(序列号27)反义引物5'國AAAGAATTCTGAGAGAGACTCTATTCCTTGTC-3，(序列号28)PC版应液的组成为1xpyrobestbufferII(TaKaRa公司)、0.2mMdNTP、0.5iaM正义和反义引物、0.025单位/ja1PyrobestDNA聚合酶(TaKaRa公司)、10ng模板DNA(pBS-OASAZ载体)，使用PCR反应装置(宝酒造公司制、TaKaRaPCRThermalCyclerMPTP3000型)，于95。C保持2分钟后，重复进行25个98。C20秒、60。C35秒、72。C3分的反应的循环，保持在72。C10分钟后，冷却至4。C。按照Sambrook等人的方法(《分子克隆第三版》(J.Sambrook和D.W.Russell,ColDSpringHarborLaboratoryPress(冷泉港实-睑室出版社)，2001))进行与载体的DNA片段的克隆。按照Kaiser等人的方法(MethodsinYeastGenetics:AColdSpringHarborLaboratoryCourseManual(酵母遗传学方法冷泉港实验室课程手册)(ChrisKaiser，SusanMichaelis,AaronMitchell,ColdSpringHarborLaboratory,1994))进4亍3寻构建的载体向酵母TRP2基因缺失变异抹的转化等基础的方法。酵母转化体，用含有2%葡萄糖的合成完全琼脂培养基(0.67%不含氨基酸的BactoYeastNitrogenBase、除去了尿嘧，定的0.2。/odropout混合物、2%细菌用琼脂)分离单菌落，然后将菌体涂布在含有2%半乳糖的合成完全琼脂培养基(0.67。/。不含氨基酸的BactoYeastNitrogenBase、除去了尿嘧啶和色氨酸的0.2。/odropout混合物、2%细菌用琼脂)上，于30。C培养两天。将20mg从琼脂培养基上刮取的菌体悬浮于105pl蒸馏水中，于100。C处理20分钟。然后，添加595iul的氯仿:曱醇混合液(5:12、v/v),充分混合后，以20,000xg的离心加速度离心分离10分钟。将获得的上清转移到新的管中，加入175jul的蒸馏水和263pl的氯仿，强烈地混合后，以20,000xg的离心加速度离心分离10分钟。这样一来，将提取的水层转移到新的管中，在减压下使之干燥后，溶解于200ial的10mMNaOH中，作为色氨酸才是取液。将其提供给高效液相色i普(HPLC)装置(Waters公司制、WatersAllianceHPLCFLDSystem2695),测定游离色氨酸含量。在该HPLC中使用的柱是XterraRP18column(4.6x150mM)(Waters公司制)，在激发波长278nm/萤光波长348nm处检测色氨酸。结果示于表2。如表2清楚所示，确认了使对色氨酸反馈抑制具有抗性的变异型OASA2基因(S126F、Y367A、A369L、S126F/L530D、Y367A/L530D、A369L/L530D、N351D/Y367A/L530D、Y367A/G522Y/L530D、Y367I/G522Y/L530D)表达的酵母中生成的游离色氨酸含量比使野生型(Wt)OASA2基因表达的酵母中所生成的积累了更高浓度(野生型的1.92.3倍)。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>实施例5:使变异型0ASA2基因表达的稻愈伤组织转化体的制备和该转化愈伤组织的游离色氨酸含量分析外源基因导入用重组载体的构建外源基因导入用重组载体的构建按照下述参考文献中记载的方法进行。参考文献l:UrushibaraS,TozawaY,Kawagishi-KobayashiM和WakasaK(2001)Efficienttransformationofsuspension-culturedricecellsmediatedbyAgrobacteriumtumefaciens(由农杆菌介导的悬浮培养的稻细胞的高效转化).BreedingScience(孵育科学)51:33-38参考文献2:TozawaY，HasegawaH，TerakawaT和WakasaK(2001)CharacterizationofriceanthranilatesynthasealfasubunitgenesOSASAlandOSASA2:tryptophanaccumulationintransgenicriceexpressingafeedback-insensitivemutantofOASAl(稻邻氨基苯甲酸合成酶oc亚基基因OSASAl和OSASA2的特点在表达反馈抑制-不敏感型的OASAl变异株的转基因稻中的氨酸积聚).PlantPhysiology(植物生理学)126:1493-1506参考文献3:HieiY,OhtaS,KomariT和KumashiroT(1994)Efficienttransformationofrice(Oryzasativa)mediatedbyAgrobacteriumandsequenceanalysisofboundariesoftheT-DNA(由农杆菌介导的稻的高外源基因导入用重组载体pUB-Hm(Urushibaraetal.，BreedingScience51:33-38(2001))带有玉米的泛素(Ubiquitin)启动子，第一内含子，和限制性内切酶Sse8387I位点，NOS终止子，潮霉素抗性基因，通过在Sse8387I位点插入目的外源基因可以构建稻转化用的重组载体。以实施例1中记载的pBS-OASA2作为模板，并且用下述中所述的正义引物和反义引物用PCR扩增全长构成的野生型(Wt)OASA2基因。在正义引物中导入限制性内切酶位点SpeI(ACTAGT)、在反义引物中导入限制性内切酶位点SalI(GTCGAC)。这些限制性内切酶位点用下划线表示。正义引物5'-AAAACTAGTATGGAGTCCATCGCCGCCGCCACG-3'(序列号43)反义引物5'-AAAGTCGACTGAGAGAGACTCTATTCCTTGTC國3'(序列号44)为得到全长的变异型OASA2基因(Y367A、Y367A/L530D),以pBS-0ASA2作为模板，用上述正义引物(序列号43)和反义引物(序列号44)，用实施例1〈用RCR法制备变异导入用DNA〉中记载的方法，制备DNA片段。用限制性内切酶SpeI和SalI消化以上的通过PCR扩增的DNA片段(l)，获得的DNA片段插入小麦胚芽无细胞合成系统用表达载体pEU3s的Spel/Sall位点，表达载体pEU3s是经修饰的表达载体pEU3b,根据Sawasaki等人(Sawasaki等人.(2002)ProcNatlAcadSciUSA(美国科学院院刊)99,14652-14657)所述，其中，在多克隆位点Spel/Sall位点的两端插入了Sse8387I位点。不同的是，用限制性内切酶Sse83871消化含有上述的变异型OASA2基因(Y367A、Y367A/L530D)或野生型(Wt)OASA2基因的pEU3s质粒载体，获得了1.8kb大小的DNA片段(2)。用DNA连接试剂盒ver.2(TaKaKabio公司制)处理上述用限制性内切酶Sse8387I消化的pUB-Hm^粒载体和DNA片|史(2),进行DNA连结反应。由此，构建环状的重组载体。该重组载体在泛素(Ubiquitin)启动子区域的下游具有第一内含子区域，在第一内含子区域与NOS终止子区域之间插入并连接变异型OASA2基因(Y367A、Y367A/L530D)或野生型(Wt)OASA2基因，并且具有含有植物中表达的潮霉素抗性基因的构造。将获得的外源基因导入用重组载体分别称为pUB-OASA2(wt)-Hm(具有野生型OASA2基因)、pUB-OASA2(Y367A)-Hm(具有变异型OASA2基因(Y367A))和pUB-OASA2(Y367A/L530D)画Hm(具有变异型OASA2基因(Y367A/L530D))。图5中表示pUB-OASA2(wt)-Hm、pBU-OASA2(Y367A)-Hm和pBU-OASA2(Y367A/L530D)-Hm的模式图。图中Pubi表示泛素(Ubiquitin)启动子区域，P35S表示花椰菜花叶病毒35S启动子区域，nos3'表示NOS终止子区域，hp滚示潮霉素抗性基因区域，Sse8387I表示限制性内切酶位点，RB表示右侧境界序列(RightBorder),LB表示左侧境界序列(LeftBorder)。<农杆菌的制备>将农杆菌(AgrobactqriumtumefaciensEHA101)移植到在50mlYEB培养基(5g/l细菌用蛋白胨、细菌用牛肉提取物5g/1、bactoyeast提取物lg/1、5g/l蔗糖、2mMMgCl2、pH7)的液体培养基中，于30。C振荡培养16小时后，通过于4。C离心分离培养溶液获得了细菌的沉淀。用水冷的10mMTris-HclpH7.5悬浮细菌的沉淀物，通过离心分离获得沉淀。将沉淀物悬浮于0.5ml的YEB培养基中。在0.2ml该菌悬浮液中分别添加上述3种外源基因导入用重组载体的溶解液(5iug),充分混合。将其立即冷冻、于37i:融解、再次冷冻融解，这样进行3次。将该悬浮液添加到16ml的YEB培养基，于30。C振荡培养2小时。将该培养液涂布于通过在L培养基(10g/l细菌用蛋白胨、5g/l细菌用酵母提取物、5g/lNaCl、15g/l细菌用琼脂、pH7.5)添加100mg/l卡那霉素和50mg/l潮霉素所构成的琼脂培养基上，于30。C培养36小时，获得了生长出的菌落作为导入了重组载体的转化农杆菌。<稻愈伤组织的制备>从稻(品种日本晴)的完熟种子中脱除稻壳。通过将获得的带着外皮的种子浸渍于70%乙醇溶液中60秒，接着，浸渍于有效氯为约4%的次氯酸钠溶液6分钟，对种子进行灭菌处理，再用无菌水清洗种子。将上述经灭菌的稻种子置于在N6培养基的无机盐组成中添加30g/l的蔗糖、2mg/l的2，4-D、lg/l的酪蛋白氨基酸和2g/l的固化剂，和N6维生素构成的2N6固体培养基(Urushibara等人.，BreedingScience(孵育科学)51:33-38(2001))中。通过28。C温育3周形成愈伤组织。从胚乳部分切出这些愈伤组织，将该愈伤组织移植到与上述相同组分的培养基中，进行7天的培养。<稻愈伤组织的转化>将如上所述获得的基因导入用的转化农杆菌悬浮于30ml液体培养基中获得菌液，所述液体培养基通过在AA培养基的组成(Hiei等人.，PlantJournal(植物杂志)6:271-282(1994))中添加20g/l的蔗糖、2mg/1的2,4-D、0.2mg/l的激动素和10mg/l的乙酰丁香酮而形成。将该悬浮液装入9cm的皿中，装入100个由上述获得的稻的愈伤组织后，使之浸渍5分钟。浸渍后，用纸巾除去多余的菌液后，将上述浸渍的愈伤组织以平均每皿20个转移到2N6CO固体培养基中，所述2N6CO固体培养基通过在N6培养基的无机盐组成中添加30g/l蔗糖、10g/l葡萄糖、2mg/12,4-D、lg/l酪蛋白氨基酸、2g/l固化剂和10mg/l乙酰丁香酮构成。于24°C,在黑暗中培养3天，进行农杆菌向稻的愈伤组织的感染。<愈伤组织的选择〉用添加500mg/l羧节青霉素所构成的无菌水清洗导入了重组载体的转化愈伤组织，除去农杆菌细菌。从愈伤组织除去多余的水分后，将愈伤组织以平均每皿20个移植到2N6SE固体培养基中，所述2N6SE固体培养基通过在N6培养基的无机盐组成中添加30g/l蔗糖、2mg/12，4-D、500mg/l羧千青霉素、30mg/l潮霉素、lg/l酪蛋白氨基酸、2mg/1固化剂构成。于28。C,在黑暗下培养3周，获得了潮霉素抗性的转化愈伤组织。再将增殖愈伤组织移植到相同组成的个体培养基上，于28。C进行3周潮霉素抗性的转化愈伤组织的培养。3周后，从扩增的愈伤组织的一部分中提取DNA,通过^f吏用下述中所述的正义引物和反义引物的PCR,鉴定转化愈伤组织。正义引物5'-GGATGGCACCCGCAGCAGATCG-3'(序列号45)反义引物5'-GTACTCATCACTTGTCATGGTTG國3'(序列号46)增，确认转化体中的0ASA2变异基因。原来所含的基因组上的OASA2基因中含有内含子序列，转化基因中不含内含子，因此402个碱基对的DNA扩增产物只来源于转化用基因。PCR反应液的组成为1xPyrobestbufferII(TaKaRa^>司)、0.2mMdNTP、0.5M正义引物(序列号45)和反义引物(序列号46)、0.025单位/ji1PyrobestDNA聚合酶(TaKaRa公司)、10ng模板DNA(愈伤组织DNA)，使用PC版应装置(宝酒造公司制、TaKaRaPCRThermalCyclerMPTP3000型)，于95。C保持2分钟后，重复进行25个98。C20秒、60。C35秒、72。C3分的反应的循环，保持在72。CIO分钟后，冷却至4。C。再按照参考文献(Tozawa等人.，PlantPhysiologyl(植物生理学)26:1493-1506(2001))中记载的方法从转化愈伤组织中提取RNA，同文献(Tozawa等人.，PlantPhysiology(植物生理学)126:1493-1506(2001))中记载的使用的地高辛标识的OASA2的RNA探针的方法进行RNA印异型基因((Y367A)或(Y367A/L530D))在选择出的愈伤组织中作为RNA表达。<转化愈伤组织的游离色氨酸含量解析-1〉对于表达变异型OASA2基因(Y367A、Y367A/L530D)或野生型(Wt)OASA2基因的稻愈伤组织这两个系统，在液氮中粉碎100mg各稻愈伤组织。将粉碎物转移到容积为1.5ml的管中，然后加入500nl的氯仿:甲醇:水混合液(5:12:3的容积比)，充分混合后、以5,000xrpm的离心加速度离心分离10分钟。将获得的上清转移到新的管中，添加375jul的蒸留水和250iul的氯仿，强烈混合后、以5,000xrpm的离心加速度离心分离10分钟。将这样获得的水层转移到新的管中，减压下使其千燥后、溶解于2ml的10mMNaOH中，作为色氨酸提取液。将其提供给高效液相色谱(HPLC)装置(Waters公司制、WatersAllianceHPLCFLDSystem2695),测定游离色氨酸含量。该HPLC中使用的柱为XterraRP18column(4.6x150mM)(Waters公司制)，在乙腈-0.1M11304水溶液(pH4.0)的浓度梯度下使用洗脱剂，乙腈浓度为5%~45%,流量为lml/分，在激发波长278nm处进行萤光波长348nm的测定，评价色氨酸含量。作为对照，使用未经转化的通常的稻(品种日本晴)的愈伤组织。获得的测定结果示于表3中。如表3清楚所示，确认了表达对色氨酸反馈抑制具有抗性的变异型OASA2基因(Y367A、Y367A/L530D)的稻愈伤组织中所生成的游离色氨酸含量比对照的稻愈伤组织积累了更高的浓度(野生型的5.538.8倍)。表3测定的稻愈伤组织游离色氨酸含量(nmol/g湿重)相对量(倍数)对照稻愈伤组织(日本晴)32±51pUB-OASA2(wt)-Hm导入愈伤组织W227±1123pUB-OASA2(wt)-Hm导入愈伤组织W2820±5134pUB-OASA2(Y367A)-Hm导入愈伤组织Yl176±12308pUB-OASA2(Y367A/L530D)-Hm导入愈伤组织Y29532±225387<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table><转化愈伤组织的游离色氨酸含量解析-2〉对于表达变异型OASA2基因(S126F/L530D)的稻愈伤组织6系统，按与上述<转化愈伤组织的游离色氨酸含量解析-1>相同的方法评l介游离色氨酸的含量。作为对照，使用未经转化的通常的稻(品种日本晴)的愈伤组织。获得的测定结果示于表4。如表4清楚所示，确认了表达对色氨酸反馈抑制具有抗性的变异型OASA2基因(S126F/L530D)的稻愈伤组织中所生成的游离色氨酸含量比对照的稻愈伤组织积累了更高的浓度(野生型的123-467倍)。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>pUB-OASA2(S126F/L530D)-Hm导入愈伤组织SL273927403pUB-OASA2(S126F/L530D)-Hm导入愈伤组织SL324558467并且，用于实施发明的最佳方式的项目中形成的具体的实施方式或实施例，彻底清楚了本发明的技术内容，其不应当是只限定于这种具体例子进行的狭义解释，在本发明的精神和权利要求的范围内，可以进行各种改变来实施。工业上利用的可能性根据本发明，可以制备高色氨酸累积植物。因此，本发明可以广泛应用于农业，而且由于高色氨酸累积植物适于家畜的飼料和食品原料，本发明也可以应用于畜产和食品产业中。权利要求1.一种多肽，其特征在于，所述多肽在序列号1中所示的氨基酸序列的第126位、第367位或第369位中的至少一个位置上具有变异，且对色氨酸生物合成途径中色氨酸产生的反馈抑制具有抗性。2.根据权利要求l所述的多肽，所述多R^序列号1中所示的^J^序列的第351位、第522位或第53(M立的至少一个位置上具有变异，其特征在于，所述多肽具有野生型稻邻^J^苯甲酸合成酶至少0.7倍以上的酶活性。3.根据权利要求1或2所述的多肽，其特征在于，所述多^所述序列号1中所示的M酸序列的第12W立的变异为将丝氨酸取代为苯丙氨酸的变异，在所述序列号l中所示的M酸序列的第367位的变异为将酪氨酸取代为丙氨酸或异亮氨酸的变异，在所述序列号l中所示的M酸序列的第369位的变异为将丙氨酸取代为亮氨酸的变异。4.根据权利要求1至3中任一项所述的多肽，其特征在于，所述多錄所述序列号1中所示的M酸序列的第351位的变异为将天冬SW^取代为天冬氨酸的变异，在所i^列号l中所示的^JJ臾序列的第522位的变异为将甘氨酸取代为酪氨酸的变异，在所述序列号l中所示的^tJJ菱序列的第530位的变异为将亮氨酸取代为丙氨酸或天4^氨酸的变异。5.根据权利要求l至4中^f—项所述的多肽，其特;fi^于，所述多肽为序列号2至7和序列号29至32中的任一项所示的^JJ臾序列构成的多肽，或序列号2至7和序列号29至32中任一项所示的tt酸序列中缺失、取^^添加了l个或多个M酸的tt酸序列构成的多肽。6.—种多肽，所述多li^邻^J^甲酸合成酶的色氨酸结合区i絲变异，其特征在于，所述多li^序列号26中所示的^J^序列的第5位有变异，并JL^"色氨妙物合成途径中色氨酸产生的反馈抑制具有抗性。7.根据权利要求6所述的多肽，其特征在于，所述多肽在所述序列号26中所示的M酸序列的第5位的变异为将酪氨酸取代为丙氨酸或异亮氨酸的变异。8.编码根据权利要求1至7中任一项所述的多肽的多核苷酸。9.根据权利要求8所述的多核苷酸，其特4^于，所述多核苷,序列号9至14和序列号33至36任一项所示的磁基序列构成的多核苷酸，或与序列号9至14和序列号33至36任一所示的碱基序列构成的多核普酸相互补的减基序列构成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸。10.才艮据4又利要求8或9所述的多核苷酸构成的转^f^^4^^用标记基因。11.含有根据权利要求8或9所述的多核苷酸的重^L4ii^体。12.导入了根据权利要求8或9所述的多核苷酸或根据权利要求11所述的重纟錄錄体，并JL4i^于色氨齡物合成途径中色氨酸产生的反馈抑制具有抗性的多肽的转>[脉。13.根据权利要求12所述的转化体，其特44于，所述转化体是植物细胞或植物体。14.从根据权利要求13所述的植物体获得的种子。15.—种转化细胞的选择方法，其特征在于，所述方法由以下步^f勾成通过在细胞中导入根据权利要求10所述的标记基因或根据权利要求l1所述的重纟錄达载体，赋予细月^f抑制细月^曽殖的色氨酸类似^^4勿的抗性，并JLi4择表i^于该色氨酸类似^^4勿的抗性的细胞。16.—种转化试剂盒，其特4iE^于，所述试剂盒至少含有根据权利要求8或9所述的多核苷酸、或根据权利要求l1所述的重^L^达载体中的任意一种。17.—种筛选方法，所述方法为篩选只与根据权利要求1至5中任一项中所述的多^野生型稻邻M苯曱酸合成酶中的任意一个结合的物质的方法，其特;f球于，所述方法包括筛选与根据权利要求1至5中^-项所述的多月;U吉合的物质的步骤，篩选与野生型稻邻M笨甲酸合成酶结合的物质的步骤，和比较上述两步骤的结果的步骤。18.—种用于实翻艮据权利要求17所述的筛选方法的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒至少含有根据权利要求1至5中任一项所述的多月沐野生型稻邻氨絲曱酸合成酶。全文摘要通过在稻邻氨基苯甲酸合成酶基因OASA2的碱基序列中导入变异，以在特定的多个氨基酸中发生取代而产生稻邻氨基苯甲酸合成酶。所述酶获得对色氨酸产生的反馈抑制的抗性，并且维持与野生型稻邻氨基苯甲酸合成酶相同或以上的酶活性。文档编号C12Q1/02GK101128584SQ20058004870公开日2008年2月20日申请日期2005年10月11日优先权日2005年2月28日发明者户泽让,若狭晓,菅野拓也申请人:国立大学法人爱媛大学;独立行政法人科学技术振兴机构;独立行政法人农业和食物综合产业技术研究机构