专利名称：一种野生型酯酶b3基因工程菌及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程和蛋白表达技术，具体地说是一种野生型酯酶B3基因工程 菌及其构建方法和应用。
背景技术：
在农业生产过程中，喷洒化学农药防治病虫害仍为不可不用的措施。严重超量的 农药残留常造成人的急性中毒，而少量的残留农药在人体中长期蓄积滞留也会引起许多慢 性疾病。据统计，75. 4%的农药中毒系由有机磷农药引起。引起农药超标准残留的原因有 将甲胺磷、对硫磷等高毒农药用于农作物，超浓度使用农药，在收获期喷洒农药等。对农药 残留量过高的农产品，仅简单地用清水洗涤，不可能消除农药残留。消除机磷农药污染残留 已经成为人们非常关心的问题。另外，长期的农药施用还造成土壤、地下水、地表水甚至大 气受到有机磷的严重污染，已经成为严重的社会问题、近年来研究证实，非特异性酯酶活性增高是蚊虫对有机磷杀虫剂产生抗性的主要 机制，酯酶在昆虫体内使有机磷酸酯类农药降解，保护昆虫免受农药毒害。酯酶B3是与蚊 虫抗药性有关的10种解毒酶中的一种，是有机磷抗性环跗库蚊体内产生的水解酶，它能有 效的水解有机磷、有机氯、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯等四大类农药。由于农药污染的日益加 剧，土著微生物已很难清除环境中大量的农药残余，因此利用转基因微生物降解农药及其 它有机物方向已成为一个研究热点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种野生型酯酶B3基因工程菌及其构建方法和应用。为实现上述目的本发明采用的技术方案为野生型酯酶B3基因工程菌野生型酯酶B3基因工程菌中的核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO. 1 中所示。所述野生型酯酶B3基因工程菌所表达的氨基酸序列如序列表SEQ IDN0. 2中所
7J\ o野生型酯酶B3基因工程菌的构建方法以环跗库蚊cDNA文库中的全序列为模板， 以分别带有Ncol和Xhol酶切位点及5’端保护碱基为引物，进行PCR扩增所得产物经Ncol 和Xhol限制性内切酶消化，而后克隆至原核表达载体，并转化至大肠杆菌表达宿主，所得 表达产物为具有如序列表SEQ ID NO. 1中所示核苷酸序列的野生型酯酶B3基因工程菌；所述引物为wB3-F:5，-CCACCATGGATGAGTTTGGAAAGC-3，，wB3-R 5’ -AGGCTCGAGTCAAAACAGCTCATCATTC-3。所述原核表达载体是指适合外源蛋白高效可溶性表达的载体；所述大肠杆菌表达 宿主菌是指适合适合外源蛋白高效可溶性表达的载体质粒表达的大肠杆菌表达宿主。所述外源蛋白高效可溶性表达的载体为pet28a ；大肠杆菌表达宿主为大肠杆菌 BL21(DE3)。
野生型酯酶B3基因工程菌的应用所述野生型酯酶B3基因工程菌经发酵后可降 解有机磷、有机氯、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯四大类化合物。所述经发酵后的野生型酯酶B3基因工程菌为将野生型酯酶B3基因工程菌于含卡 那霉素的液体LB培养基中过夜培养，然后以体积百分比的接种量转接下一级，37°C摇 床培养至0D_为0.6，而后加入终浓度1. Ommol/L的IPTG，30°C诱导表达6小时，收集发酵 菌液，直至细胞破碎完全离心待用。本发明具有如下优点1.本发明利用相对简单的大肠杆菌为基因工程菌，产生大量具有生物学活性的酯 酶B3蛋白，获得可以降解有机磷类化合物的微生物培养物，并且所得微生物的培养物致病 性较低，对环境不具有潜在威胁。2.本发明所得野生型酯酶B3基因工程菌培养物可用于受有机磷污染区域的生物 修复。3.本发明所得野生型酯酶B3基因工程菌培养物可有效的对有机磷类化合物进行 降解。
图1为本发明野生型酯酶B3基因工程菌BL21(DE3)/pet28a-b3的发酵液的酯酶 活性检测图(其中以BL21(DE3)/pet 28a作为阴性对照。)。
具体实施例方式实施例11)对有机磷杀虫剂有抗性的环跗库蚊cDNA文库质粒DNA的提取将质粒 pUC_b3(购自加拿大Queen，s University大学)转入大肠杆菌DH5 a，将该单菌落接种于 含有lOOii g/ml氨苄青霉素的5ml液体LB培养基中，37°C摇床过夜培养，取1. 5ml的培养 物离心收集菌体。提取质粒DNA作为PCR反应模板(质粒DNA提取操作按F.奥斯伯，R.布 伦特，R.E.金斯顿，D.D.穆尔，J.G.塞德曼，J.A.史密斯，K.斯特拉尔《精编分子生物学实 验指南》美国纽约John Wiley & Sons出版社2005年第四版P20)。2)设计编码野生型酯酶B3全基因序列b3的引物设计一对分别带有Ncol和Xhol 酶切位点及5’端保护碱基的引物如下wB3-F 5' -CCACCATGGATGAGTTTGGAAAGC-3’wB3-R 5' -AGGCTCGAGTCAAAACAGCTCATCATTC-3，3)编码野生型酯酶B3全基因序列b3的PCR扩增反应体系为dOXPyrobest buffer 5iil、dNTP 250umol,0. 02% BSA 2 ii 1、上下游引物各 25pmol、模板基因组 DNA 0. 1 u g、Pyrobest DNA聚合酶(TaKaRa公司产品)2U，无菌超纯水补齐体积至50 yl。PCR反应条件为第一阶段95°C，5分钟；第二阶段94°C，45秒；55°C，45秒；72°C，2分钟；共30个循环；第三阶段72 °C，10分钟4)PCR扩增产物经0. 8%琼脂糖凝胶电泳分析，切下目的带，其大小约为1600bp， 按杭州维特洁生化技术有限公司胶回收试剂盒使用说明书进行胶回收。
5)野生型酯酶B3原核异源表达载体pet28a_b3的构建将纯化后的PCR产物片段 经Ncol和Xhol限制性内切酶消化，以T4 DNA连接酶连接，将其连接入经同样双酶切的pet 28a表达载体，构建成表达载体pet28a-b3，转化E. coli BL21(DE3)感受态细胞(转化操作 按F.奥斯伯，R.布伦特，R.E.金斯顿，D.D.穆尔，J.G.塞德曼，J.A.史密斯，K.斯特拉尔 《精编分子生物学实验指南》美国纽约John Wiley & Sons出版社2005年第四版P25)，提 取质粒DNA，经Ncol和Xhol双酶切鉴定正确重组克隆，并以Smger双脱氧末端终止法测定 DNA序列(参见序列表1)。所述序列表SEQ ID NO 1中的碱基序列atgagtttggaaaacttgaccatccagaccaaatacggtccggttcggggcaaacggaatgtgtccctg ctgggacaggagtacgtcagctttcaaggaattccgtacgcccgggcacccgagggagagctgagattcaagccccc agttccgccaccaaagtggaccgaaacgttggactgcacgcaacaatgtgaaccctgctatcatttcgaccgccgca tccagaagatcgttggaagtgaggatagtctgaagatcaacgtgtttgcaaaagagatcaacccgtcaaatccgctt ccggtattgctatacatctacggcggtggtttcacggaaggaactagcggaaccgagttgtacgggccggatttcct gatccagaaagacatcgtgctggtaacgttcaactatcgcatcggagcgttgggctttctttgctgccagtcggagg aggatggcgtgcccggtaatgccggactcaaagatcagaacttggccattcggtgggtgctggagaacattgcggcc tttggaggagatcccaaacgtgtgaccttggctggtcatagcgcgggagctgcttccgttcagtatcatctgatatc ggatgcttccaaggacttgtttcaacgggctatcgttatgtccgggagtacgtattccagttggtcgctgactaggc aacgcaactgggttgaaaagttggcgaaaactatcggttgggatggagaaggtggtgagtccggtgcgttgagattc ttaagggctgccaagccggaggacattgtagctaaccaagagaagctattgactgccgaggacatgcaggaagatat cttcacaccttttggacctaccgttgaaccgtacttgacggagcagtgcataatccctaaggaacctttcgagatgg ctcggaatgcttggggagacacgattgatgtcatgattgggggaacgtccgaggaaggactgctgctgctacaaaag gtcaagttgcaaccggaacttttgtcccatcctcatttgttcctgggaaatgttccgccgcatttgaagatcagcat ggaacagcgagttgcgttcgctgtcaagctgaaacaacgttactaccccgacagcgatccttcgatggagaacaaca gcggatacgttcatatgatgaccgaccgggtcttctggcatggcctccaccgaaccatcctggcccgagctgctcga tcgcaggcccgcacgttcgtgtatcggatctgtctggactcggagttctacaaccactaccgcatcatgatgatcga cccgaagctgcgcggaacggtccacgccgacgagttgtcctacctcttttccaactttacccagcaggtccccggga aggaaaccttcgagttccgtggactgcaaaccctggtggatgtgttcacctcgttcgtcatcaatggcgatccaaac tgtgagatgacgtcgaacagcggagtggtctttgaaccgaacgggcagacgaagcccacgttcaagtgtttgaacgt gtccaacgagggggtggctttcatagattatccggatcccgaccggttggacatgtgggacgcaatgtacgtgaacg
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(a)序列特征
*长度1623碱基对
*类型核酸
*链型双链
*拓扑结构线性
(b)分子类型cDNA
(c)假设否
(d)反义否
(e)最初来源环跗库蚊
所述提取质粒DNA，经NcoI和XhoI双酶切鉴定正确重组克隆，并以Sanger双脱氧 末端终止法测定DNA序列，所编码的蛋白具有序列表2中所示的氨基酸；所述序列表SEQ ID NO 2中的氨基酸序列MSLENLTIQTKYGPVRGKRNVSLLGQEYVSFQGIPYARAPEGELRFKPPVPPPKWTETLDCTQQCEPCY HFDRRIQKIVGSEDSLKINVFAKEINPSNPLPVLLYIYGGGFTEGTSGTELYGPDFLIQKDIVLVTFNYRIGALGFL CCQSEEDGVPGNAGLKDQNLAIRWVLENIAAFG⑶PKRVTLAGHSAGAASVQYHLISDASKDLFQRAIVMSGSTYSS WSLTRQRNWVEKLAKTIGWDGEGGESGALRFLRAAKPEDIVANQEKLLTAEDMQEDIFTPFGPTVEPYLTEQCIIPK EPFEMARNAWGDTIDVMIGGTSEEGLLLLQKVKLQPELLSHPHLFLGNVPPHLKISMEQRVAFAVKLKQRYYPDSDP SMENNSGYVHMMTDRVFffHGLHRTILARAARSQARTFVYRICLDSEFYNHYRIMMIDPKLRGTVHADELSYLFSNFT QQVPGKETFEFRGLQTLVDVFTSFVINGDPNCEMTSNSGVVFEPNGQTKPTFKCLNVSNEGVAFIDYPDPDRLDMWD AMYVNDELF(a)序列特征*长度540残基*类型氨基酸*链型单链*拓扑结构线性(b)分子类型蛋白质(C)假设否(d)反义否(e)最初来源环跗库蚊实施例2野生型酯酶B3基因工程菌发酵液酯酶活性的测定1) α -乙酸萘酯(α -ΝΑ)、β -乙酸萘酯(β -ΝΑ)为酯酶Bl的特异性底物。由于 酶促反应的产物量与OD值成正比，如果工程菌的酯酶活性越强，则OD值越大。2)所述野生型酯酶Β3蛋白在大肠杆菌BL21(DE 3)中的异源表达将实施例1 中所得的野生型酯酶B3工程菌单菌落于含40ug/ml卡那霉素的液体LB培养基中，过夜活 化培养，以接种量转接下一级，37°C摇床培养至0D_为0. 6，加入终浓度1. Ommol/L的 IPTG，30°C诱导表达6小时，收集发酵菌液。3)将上述诱导表达后的工程菌液按表1加样，于37°C反应不同时间，然后向各试 管加0. 5mL DBLS (固蓝十二烷酸溶液)，室温静置15min，测定0D550吸收值，从而确定酯酶 的活性。每个反应做三个重复平行对照，结果参见图1。表1.酶活测定溶液组成 β -NA ( μ 1 ) 40 404040404040 工程菌培养液(ml) 0.8 0.80.80.80.80. 80.8 反应时间(h)_O_0. 51. O1. 52. Q2. 53. O其中，DBLS溶液将质量百分比的固蓝B溶液与质量百分比5%的SDS溶液 按2 5的比例混勻。PBS磷酸缓冲液(F.奥斯伯，R.布伦特，R.E.金斯顿，D. D.穆尔， J.G.塞德曼，J.A.史密斯，K.斯特拉尔《精编分子生物学实验指南》美国纽约John Wiley& Sons 出版社 2005 年第四版 P887)。0 -NA 0. 02mg/ml 溶于 PBS 中。实施例3野生型酯酶B3工程菌菌体破碎蛋白液对蔬菜叶片有机磷农药的降解活性测定1)所述野生型酯酶B3蛋白在大肠杆菌BL21(DE 3)中的异源表达将实施例1 中所得的野生型酯酶B3工程菌单菌落于含40ug/ml卡那霉素的液体LB培养基中，过夜活 化培养，以接种量转接下一级，37°C摇床培养至0D_为0. 6，加入终浓度1. Ommol/L的 IPTG，30°C诱导表达6小时，收集发酵菌液。2)将上述所得的发酵菌液，4°C下以6，000g离心lOmin收集菌体，每100ml发酵液 收集的菌体以50ml的PBS溶液重悬，于4°C超声波破碎菌体，直至细胞破碎完全。4°C下以 12，000g离心30min收集上清液作为农药降解粗剂备用。取无施用任何农药小白菜100g叶片洗净晾干，用含马拉硫磷的农药均勻喷洒，晾 干后分成两份，一份50g喷洒农药降解粗剂50ml，另一份50g喷洒PBS溶液50ml，静置lh。 每份叶片放入100ml去离子水中，勻浆机中勻浆处理，抽滤分离固液相，滤液用50ml石油醚 萃取三次，收集有机相；固相残渣用50ml石油醚洗涤三次，收集滤液。合并萃取有机相和滤 液，用无水硫酸钠干燥。用旋转蒸发仪浓缩有机相至约5ml，定容至10ml。用气相色谱法分 析浓缩液中的农药含量，并计算降解率。降解率=(降解粗剂作用的样品-PBS作用的样品)+PBS作用的样品X 100%同样，用辛硫磷、甲基异硫磷农药分别重复进行如上实验，计算降解率，实验结果 见表2.表2.基因工程菌菌体破碎蛋白液对蔬菜叶片有机磷农药的降解活性 由表2降解率可知所述野生型酯酶B3基因工程菌经发酵后可降解多种有机磷类 农药。序列表.txtSEQUENCE LISTING<110>石元亮张惠文卢宗云<120> 一种野生型酯酶B3基因工程菌及其构建方法和应用<130><160>2<170>PatentIn version 3. 1<210>1<211>1623<212>DNA<213>环跗库蚊<220><221>CDS
<222>(1). . (1623)<223><400>1atg agt ttg gaa aac ttg acc ate cag acc aaa tac ggt ccg gtt egg 48Met Ser LeuGlu Asn Leu Thr lie Gln Thr Lys Tyr Gly Pro Val Arg151015ggc aaa egg aat gtg tcc ctg ctg gga cag gag tac gtc age ttt caa 96Gly Lys Arg Asn Val Ser Leu Leu Gly Gln Glu Tyr Val Ser Phe Gln202530gga att ccgtac gcc egg gca ccc gag gga gag ctg aga ttc aag ccc 144Gly lie ProTyr Ala Arg Ala Pro Glu Gly Glu Leu Arg Phe Lys Pro354045cca gtt ccgcca cca aag tgg acc gaa acg ttg gac tgc acg caa caa 192Pro Val ProPro Pro Lys Trp Thr Glu Thr Leu Asp Cys Thr Gln Gln505560tgt gaa ccctgc tat cat ttc gac cgc cgc ate cag aag ate gtt gga 240Cys Glu ProCys Tyr His Phe Asp Arg Arg lie Gln Lys lie Val Gly65707580agt gag gatagt ctg aag ate aac gtg ttt gca aaa gag ate aac ccg 288Ser Glu AspSer Leu Lys lie Asn Val Phe Ala Lys Glu lie Asn Pro859095tea aat ccgctt ccg gta ttg cta tac ate tac ggc ggt ggt ttc acg 336Ser Asn ProLeu Pro Val Leu Leu Tyr lie Tyr Gly Gly Gly Phe Thr100105110gaa gga actage gga acc gag ttg tac ggg ccg gat ttc ctg ate cag 384Glu Gly ThrSer Gly Thr Glu Leu Tyr Gly Pro Asp Phe Leu lie Gln115120125aaa gac ategtg ctg gta acg ttc aac tat cgc ate gga gcg ttg ggc 432Lys Asp lieVal Leu Val Thr Phe Asn Tyr Arg lie Gly Ala Leu Gly130135140ttt ctt tgctgc cag tcg gag gag gat ggc gtg ccc ggt aat gcc gga 480Phe Leu CysCys Gln Ser Glu Glu Asp Gly Val Pro Gly Asn Ala Gly145150155160ctc aaa gatcag aac ttg gcc att egg tgg gtg ctg gag aac att gcg 528Leu Lys AspGln Asn Leu Ala lie Arg Trp Val Leu Glu Asn lie Ala165170175gcc ttt ggagga gat ccc aaa cgt gtg acc ttg get ggt cat age gcg 576Ala Phe GlyGly Asp Pro Lys Arg Val Thr Leu Ala Gly His Ser Ala
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权利要求
一种野生型酯酶B3基因工程菌，其特征在于野生型酯酶B3基因工程菌中的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1中所示。
2.一种按权利要求1所述的野生型酯酶B 3基因工程菌，其特征在于所述野生型酯 酶B3基因工程菌所表达的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. 2中所示。
3.一种按权利要求1所述的野生型酯酶B3基因工程菌的构建方法，其特征在于以环 跗库蚊cDNA文库中的全序列为模板，以分别带有Ncol和Xhol酶切位点及5’端保护碱基 为引物，进行PCR扩增所得产物经Ncol和Xhol限制性内切酶消化，而后克隆至原核表达载 体，并转化至大肠杆菌表达宿主，所得表达产物为具有如序列表SEQ ID NO. 1中所示核苷酸 序列的野生型酯酶B3基因工程菌；所述引物为wB3-F :5，-CCACCATGGATGAGTTTGGAAAGC-3，，wB3-R :5’ -AGGCTCGAGTCAAAACAGCTCATCATTC-3，。
4.按权利要求1所述的野生型酯酶B3基因工程菌的构建方法，其特征在于所述原核 表达载体是指适合外源蛋白高效可溶性表达的载体；所述大肠杆菌表达宿主菌是指适合适 合外源蛋白高效可溶性表达的载体质粒表达的大肠杆菌表达宿主。
5.按权利要求4所述的野生型酯酶B3基因工程菌的构建方法，其特征在于所述外源 蛋白高效可溶性表达的载体为pet28a ；大肠杆菌表达宿主为大肠杆菌BL21 (DE3)。
6.一种按权利要求1所述的野生型酯酶B3基因工程菌的应用，其特征在于所述野生 型酯酶B3基因工程菌经发酵后可降解有机磷、有机氯、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯四大类化 合物。
7.按权利要求6所述的野生型酯酶B3基因工程菌的应用，其特征在于所述经发酵后 的野生型酯酶B3基因工程菌为将野生型酯酶B3基因工程菌于含卡那霉素的液体LB培养 基中过夜培养，然后以体积百分比的接种量转接下一级，37°C摇床培养至0D■为0.6， 而后加入终浓度1. Ommol/L的IPTG，30°C诱导表达6小时，收集发酵菌液，直至细胞破碎完 全离心待用。
全文摘要
本发明涉及基因工程和蛋白表达技术，具体地说是一种野生型酯酶B 3基因工程菌及其构建方法和应用。具体野生型酯酶B3基因工程菌中的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。构建以环跗库蚊cDNA文库中的全序列为模板，以分别带有NcoI和XhoI酶切位点及5’端保护碱基为引物，进行PCR扩增所得产物经限制性内切酶消化后克隆至原核表达载体，并转化至大肠杆菌表达宿主，表达产物即为所得；所述基因工程菌经发酵后可降解有机磷、有机氯、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯四大类化合物。本发明利用简单的大肠杆菌为基因工程菌，产生大量具有生物学活性的酯酶B3蛋白，获得降解有机磷类化合物的微生物培养物，并且所得微生物的培养物致病性较低，可用于受有机磷污染区域的生物修复。
文档编号C12N1/00GK101857838SQ20091001107
公开日2010年10月13日 申请日期2009年4月8日 优先权日2009年4月8日
发明者卢宗云, 张惠文, 石元亮 申请人:石元亮;张惠文;卢宗云