一种基因载体系统及其制备方法
【专利摘要】本发明提供一种基因载体系统，包括：pH敏感遮蔽体系、阳离子载体和基因物质；所述pH敏感遮蔽体系为聚谷氨酸酯与2-叔丁氧羰基氨基乙硫醇和巯基乙酸反应并脱叔丁氧羰基保护得到的聚合物，所述聚谷氨酸酯由聚乙烯亚胺或小分子烷胺引发γ-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐开环聚合得到；所述pH敏感遮蔽体系与阳离子载体的质量比为(2～100)：1；所述pH敏感遮蔽体系与基因物质的质量比为(5～80)：1；所述基因物质为质粒DNA或siRNA。本发明还提供了一种基因载体系统的制备方法以及一种氨基酸聚合物。本发明提供的基因载体引入了更多的带电基团，减少了遮蔽体系的用量，降低了应用时因遮蔽体系而产生的细胞毒性。
【专利说明】ー种基因载体系统及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物载体领域，特别涉及基因载体系统及其制备方法。
【背景技术】
[0002]基因治疗作为一种新兴的治疗模式已经有了很大的发展，在人类攻克遗传疾病及癌症等顽症的过程中占据着重要地位，并逐步成为ー种常见的有效手段。基因治疗是指将外源正常基因导入靶细胞以纠正基因的缺陷和异常引起的疾病，从而达到治疗目的的生物医学新技木。利用载体将外源基因导入靶细胞是ー种基因治疗的有效方法，成功的基因治疗对基因载体的依赖性很大。常见的载体包括病毒类载体和非病毒载体，但是病毒类载体在临床应用中存在着很大的安全隐患，在基因治疗历史上不乏有患者死亡事件及并发症等的出现，在很大程度上都是由病毒类基因载体的不安全性造成的。
[0003]非病毒载体多为高分子阳离子聚合物，因其安全、有效、无免疫原性等优点，已成为病毒类载体最有希望的替代者。其中阳离子聚合物聚乙烯亚胺是非病毒类载体中受到关注最多的一个(Molecular design oi functional polymers lor gene therapy.JeongJH, Kim SW, Park TG.Park.Prog.Polym.Sc1.2007 ；32(11):1239-1274),它在体外和体内的转染实验中得到应用并取得了一定的效果，但由于其毒性高、转染效率低于病毒类载体、在体内运输过程的非特异性吸附以缺乏靶向性等缺点，阻碍了它的进ー步发展(Genetransfer with lipospermines and poiyethyienimines.Remy JS，Abdalian B，ZantaMAj Boussif 0，Behr JPj Demeneix B.Adv.Drug Deliver.Revl998Mar2 ；30(l-3):85-95.)D
[0004]肿瘤的理想基因治疗过程为:载有基因物质的基因载体在血液中循环，到达肿瘤组织后被肿瘤细胞内吞并完成转染治疗。但是，血液中含有很多带负电的蛋白类物质，带正点的载体容易与其吸附凝聚成大颗粒而发生沉淀(Poly (glycoamidoamine) s for genedelivery, structural ef`iects on cellular internalization, Duffermg capacity, andgene expression。Liu，Y，and Reineke，T.M.Bioconjugate Chem.2007 ;18，19-30.);而且，正常体液环境中的细胞表面带负电，带正电的载体也容易接近正常细胞，被正常细胞内呑，因此，载体难于到达肿瘤组织，导致转染效率低。
[0005]为了提高基因载体体系进入目标组织细胞的效率，常用的方法是引入遮蔽体系。遮蔽体系通常选用带负电的高分子材料，复合在基因载体体系表面，使整个颗粒带负电。避免在血液运输过程中的非特异性吸附。但引入的遮蔽体系表面所帯的负电会与细胞表面带负电荷产生斥力，影响载体体系与细胞的结合效率，致使其转染效率低。
【发明内容】
[0006]有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供ー种基因载体系统，本发明提供的基因载体系统具有较高的转染效率。
[0007]本发明提供了ー种基因载体系统，包括:pH敏感遮蔽体系、阳离子载体和基因物质；[0008]所述pH敏感遮蔽体系为聚谷氨酸酯与2-叔丁氧羰基氨基こ硫醇和巯基こ酸反应并脱叔丁氧羰基保护得到的聚合物，所述聚谷氨酸酯由聚乙烯亚胺或小分子烷胺引发
Y-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐开环聚合得到；
[0009]所述pH敏感遮蔽体系与阳离子载体的质量比为(2~100):1 ；
[0010]所述pH敏感遮蔽体系与基因物质的质量比为(5~80):1 ;
[0011]所述基因物质为质粒DNA或siRNA。
[0012]优选的，所述聚谷氨酸酯中，Y-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐与聚乙烯亚胺的质量比为(1.5~50):1, y -丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐与小分子烧胺的质量比为(2 ~200):1。
[0013]优选的，所述pH敏感遮蔽体系中，聚谷氨酸酯中所含氮的摩尔数与2-叔丁氧羰基氣基こ硫醇中所含疏基和疏基こ酸所含疏基的摩尔数之和的比例为1:(2~20);所述
2-叔丁氧羰基氨基こ硫醇与巯基こ酸的摩尔比为1:(0.1~10)。
[0014]优选的，所述阳离子载体与基因物质的质量比为(0.5~50):1。
[0015]优选的，所述阳离子载体为聚乙烯亚胺，其数均分子量为500~40000。
[0016]优选的，所述pH敏感遮蔽体系中，聚乙烯亚胺具有式I线性结构或式II支化结
构，
[0017]
【权利要求】
1.ー种基因载体系统，包括:pH敏感遮蔽体系、阳离子载体和基因物质； 所述PH敏感遮蔽体系为聚谷氨酸酯与2-叔丁氧羰基氨基こ硫醇和巯基こ酸反应并脱叔丁氧羰基保护得到的聚合物，所述聚谷氨酸酯由聚乙烯亚胺或小分子烷胺引发Y-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐开环聚合得到； 所述PH敏感遮蔽体系与阳离子载体的质量比为(2~100):1 ； 所述PH敏感遮蔽体系与基因物质的质量比为(5~80):1 ； 所述基因物质为质粒DNA或siRNA。
2.根据权利要求1所述的基因载体系统，其特征在于，所述聚谷氨酸酯中，Y-丙炔基--谷氨酸-N-内羧酸酐与聚乙烯亚胺的质量比为(1.5~50):1，Y-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐与小分子烧胺的质量比为(2~200):1。
3.根据权利要求1所述的基因载体系统，其特征在于，所述PH敏感遮蔽体系中，聚谷氨酸酯中所含氮的摩尔数与2-叔丁氧羰基氨基こ硫醇中所含巯基和巯基こ酸所含巯基的摩尔数之和的比例为1:(2~20);所述2-叔丁氧羰基氨基こ硫醇与巯基こ酸的摩尔比为1:(0.1 ~10)。
4.根据权利要求1所述的基因载体系统，其特征在于，所述阳离子载体与基因物质的质量比为(0.5~50):1。
5.根据权利要求1所述的基因载体系统，其特征在于，所述阳离子载体为聚乙烯亚胺，其数均分子量为500~40000。
6.根据权利要求1所述的基因载体系统，其特征在于，所述pH敏感遮蔽体系中，聚乙烯亚胺具有式I线性结构或式II支化结构，
7.根据权利要求1所述的基因载体系统，其特征在于，所述pH敏感遮蔽体系中，聚乙烯亚胺的数均分子量为500~25000，小分子烷胺的分子量为50~500。
8.ー种基因载体系统的制备方法，包括以下步骤: A)将基因物质与阳离子载体混合孵育，得到二元复合物； 所述基因物质为质粒DNA或siRNA ; B)将所述二元复合物与pH敏感遮蔽体系混合，得到基因载体系统； 所述PH敏感遮蔽体系为聚谷氨酸酯与2-叔丁氧羰基氨基こ硫醇和巯基こ酸反应并脱叔丁氧羰基保护得到的聚合物，所述聚谷氨酸酯由聚乙烯亚胺或小分子烷胺引发Y-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐开环聚合得到； 所述PH敏感遮蔽体系与阳离子载体的质量比为(2~100):1 ； 所述PH敏感遮蔽体系与基因物质的质量比为(5~80):1 ； 所述基因物质为质粒DNA或siRNA。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述聚谷氨酸酯中，Y-丙炔基-し-谷氨酸-N-内羧酸酐与聚乙烯亚胺的质量比为(1.5~50):1，Gamma-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐与小分子烧胺的质量比为(2~200):1。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述混合孵育的时间为10~30分钟。
11.一种氨基酸聚合物，为聚谷氨酸酯与2-叔丁氧羰基氨基こ硫醇和巯基こ酸反应并脱叔丁氧羰基保护得到的聚合物；所述聚谷氨酸酯由聚乙烯亚胺或小分子烷胺引发Y-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐开环聚合得到。
12.根据权利要求11所述的氨基酸聚合物，其特征在于，所述聚谷氨酸酯中所含氮的摩尔数与2-叔丁氧羰基氨基こ硫醇中所含巯基和巯基こ酸所含巯基的摩尔数之和的比例为1: (2~20);所述2-叔丁氧羰基氨基こ硫醇与巯基こ酸的摩尔比为1:(0.1~10);所述Y-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐与聚乙烯亚胺的质量比为(1.5~50):1 ;所述Y-丙炔基-L-谷氨酸-N-内羧酸酐与小分子烷胺的质量比为(2~200):1。
【文档编号】C12N15/87GK103497961SQ201310442744
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年9月25日 优先权日:2013年9月25日
【发明者】田华雨, 焦自学, 陈学思, 林琳, 郭兆培, 陈杰 申请人:中国科学院长春应用化学研究所