uman Notch肥XT基因。待转染6小时后，分别用20uM、50uM浓度 的双居麦角汀处理细胞，加相同浓度的DMSO做对照，并加20uM的DAPT做对照，同时更换细 胞培养液。待处理24h后，细胞用含有1% NP-40的裂解液裂解，取相同蛋白量的蛋白进行 凝胶电泳，并用C-T15检测APP表达量的变化及APP-CTF积聚或用Notch 1744检测NICD 量的变化。目-actin作为内参。结果如图4所示；双居麦角汀影响APP的剪切过程但是不 影响Y -分泌酶介导的NICD的产生。
[0099] 实施例7、测定不同浓度的化合物双居麦角汀对细胞内Y -分泌酶各组分表达量 的影响
[0100] 在24孔板中接种500ul浓度2X IO5个/ml的肥K293或者AG细胞。待细胞生 长24h后分别用20uM、10uM、5uM、2uM浓度的双居麦角汀处理细胞，加相同浓度的DMSO做 对照，并加20uM的DAPT做对照，同时更换细胞培养液。待处理24h后，细胞用含有1 % NP-40的裂解液裂解，取相同蛋白量的蛋白进行凝胶电泳，并检测Y-分泌酶各组分表 达量；nicastrin(NCT164)、全长的 PSlor PSl-NTF (MAB1563)或 PSl-NTF (油 134195)和 化n-2〇JD-l)，目-actin作为内参。结果如图5所示；双居麦角汀不影响细胞内Y-分泌酶 各组分的表达。因此，双居麦角汀可能是Y-分泌酶的直接抑制剂。
[0101] 实施例8、不同浓度的双居麦角汀在体外Y-分泌酶纯酶活力测定体系中对Y-分 泌酶活性的影响
[0102] 体外Y -分泌酶纯酶活力测定按照化trick C. Rraering中 Biochemistry. 43, 9774-89 (2004)中描述的方法，简述如下；将 200uM、100uM、50uM、20uM 浓 度的双居麦角汀与纯化的Y -分泌酶（0. 2% CHAPSO-肥阳S buffer)、IuM的ClOO-Flag底 物37度赔育地。反应加入终浓度为0. 5%的SDS终止。反应样品用16% Tricine-SDS-PAGE 分离并用抗体C-T15检测产物AICD-Flag的量、6E10检测A-beta的量，同时，用Odyssey软 件对灰度进行定量。结果如图6所示；在体外纯酶体系中，双居麦角汀计量依赖性的抑制 Y-分泌酶纯酶活力，其IC50约为lOOuM。双居麦角汀是Y-分泌酶的直接抑制剂。
[0103] 实施例9、化合物双居麦角汀对A目比例的影响
[0104] 体外Y -分泌酶纯酶活力测定样品用BicineAirea SDS-PAGE胶分离，分离时，上 样合成的A目38、A目40、A目42作为标准品。然后用抗体6E10检测反应物中A目的量，相应 的样品也用A目40和A目42化ISA试剂盒检测。结果如图7所示；在体外纯酶体系中，双居 麦角汀W相同比例降低AP 40和AP 42的量而不影响A目的比例。
[0105] 实施例10、化合物双居麦角汀的构效关系研究
[0106] 将200UM浓度的双居麦角汀及其类似物与纯化的Y -分泌酶（0. 2 % CHAPSO-肥阳訊Uffer)、IuM的ClOO-Flag底物37度赔育地。反应加入终浓度为0. 5 %的 SDS终止。反应样品用16% Tricine-SDS-PAGE分离并用抗体C-T15检测产物AICD-Flag 的量。结果如图8所示。
[0107] 本发明中用Compd. 1指代双居麦角汀值ihy化oergocristine);用Compd. 2指代 二氨麦角胺值ihy化 oergotamine);用 Compd. 3 指代 a-麦角隐亭（Q-ErgociTPtine); Compd. 4 指代 2-漠-麦角隐亭 O-Bromo- a -ergociTptine);用 Compd. 5 指代麦角 胺Ergotamine);用Compd. 6指代甲麦角林（Metergoline);用Compd. 7指代培高利特 (Pergolide)。用 Compd. 8 指代甲基麦角新验（Methylergometrine);用 Compd. 9 指代 CABA ; 用 Compd. 10 指代 AMBE。
[010引 表1
[01川 +++ ;与200uM的双居麦角汀相比，该化合物的在200uM条件下具有较高的抑制活 性；
[011引 ++ ;与200uM的双居麦角汀相比，该化合物的在200uM条件下具有相似水平的抑制 活性；
[0113] 本发明研究了化合物双居麦角汀的类似物作为Y-分泌酶抑制剂的的构效关系， 结果如表1所示，双居麦角汀的类似物Compd. 3 a -麦角隐亭（a -Ergoarptine)在200uM 条件下也能够抑制Y-分泌酶活力。Compd. 1双居麦角汀值ihy化oergocristine)和 Compd. 3 a -麦角隐亭（a -Ergoarptine)在R2位置均含有相当于苯丙氨酸或者亮氨酸侧 链基团的疏水结构。Metergoline、Pergolide和meth}dergomet;rine送H个只含有麦角酸 结构而不含有环H肤结构的类似物同样不能抑制Y-分泌酶活力。因此，在Rl位置上含有 疏水结构基团的环H肤结构对于该类化合物是重要的。只含有环H肤结构且在Rl位置为 鄉氨酸侧链基团的CABA能够明显的抑制Y -分泌酶活力而非环状H肤结构的AMBE却没有 抑制活性的结果更进一步证明了环H肤结构对维持该类化合物的抑制活性的重要性。综上 所述，环H肤结构是该类Y-分泌酶抑制剂的最小结构基团。
[0114] W上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制， 应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可W做出 若干改进和补充，送些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员， 在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用W上所掲示的技术内容而做出的些许更 动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对 上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围 内。
【主权项】
1. 结构式如式I所示的化合物或其药物可接受的盐作为有效成分在制备y-分泌酶抑 制剂中的用途，所述R1选自如式II或III所示的结构：所述R2为疏水结构。2. 结构式如式I所示的化合物或其药物可接受的盐作为有效成分在制备阿尔兹海默 症治疗药物中的用途，所述R1选自如式II或III所示的结构：所述R2为疏水结构。3. 根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述R2选自如式IV、V、VI或VII所 示的结构：4.根据权利要求1或2所示的用途，其特征在于，所述化合物的结构式如式VIII至XI 所示：5. 根据权利要求1-4任一权利要求所述的用途，其特征在于，所述结构如式I所示的 化合物或其药物可接受的盐通过抑制APP剪切途径起到抑制Y -分泌酶活力的作用。6. 根据权利要求1-4任一权利要求所述的用途，其特征在于，所述结构如式I所示的 化合物或其药物可接受的盐为唯一有效成分抑制APP剪切途径起到抑制Y -分泌酶活力的 作用。7. -种阿尔兹海默症治疗药物组合物，至少包含如式I所示的化合物或其药物可接受 的盐。8.根据权利要求7所述的药物组合物，含有安全有效量的如式I所示的化合物或其药 物可接受的盐，余量为药学上可接受的载体。
【专利摘要】本发明涉及药物研发领域，具体公开了一种γ-分泌酶抑制剂及其应用。本发明经试验首次揭示了如式Ⅰ所示的化合物或其药物可接受的盐，在uM浓度条件下即能够有效地抑制γ-分泌酶活力，且明显地降低细胞水平Aβ量，但是不影响NOTCH的剪切过程，特异性好；如式Ⅰ所示的化合物或其药物可接受的盐能够用于制备γ-分泌酶抑制剂或在制备阿尔兹海默症治疗药物，安全可靠，具有较好的临床应用前景。
【IPC分类】A61P25/28, A61K31/4985
【公开号】CN105560244
【申请号】CN201410528587
【发明人】吴方, 雷希岭
【申请人】上海交通大学
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2014年10月10日