专利名称：用于对猪体内特定基因进行筛选及功能分析的cDNA芯片的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于猪基因的筛选以及功能分析的cDNA芯片。尤其是，本发明涉及一种筛选猪基因并分析其功能的技术，该技术是通过制备一种cDNA芯片来完成的，所述芯片包含一探针，用于检测在猪的肌肉和脂肪组织中特异性表达的标志基因，其中该探针包含从组织中分离的4434ESTs，能够与标志基因互补性结合，该技术用于猪种改良。
背景技术：
在国内养猪业需要依赖国外的伺料和猪供给的情况下，为增加在饲养公猪的农场中的价值创造，创收外币，增加国内的猪饲养工业的竞争性，有必要获得具有优良特性的猪种。为完成这一任务，本发明人筛选了猪体内与肉品质相关的特定基因，并利用该基因制备了cDNA芯片。利用该特定基因转化的猪进行生产，育种，并繁殖这种新品种，从而大大提高了养猪农场的净增值，因此猪基因的功能分析成为必不可少的步骤。
在过去几年中，猪基因组连锁图谱和物理图谱的研究已经取得了显著的进步。PiGMaP项目在欧洲启动，现在已有18个欧洲实验室、以及来自美国、日本和澳大利亚的总共7个实验室参与该项目。目前，猪体内约1,800个标记物和基因已经被定位(Archibald et al.1994；Marklund et al.1996；Rohrer et al.1996)。目前猪的物理基因图谱包括600多个基因。已在染色体上发现候选基因一些数量性状座(QTL)的扫描和定位，且已经鉴定出与猪的经济特性相关的主要基因。与生长和背部脂肪相关的基因存在于染色体3，4，5，6，7，8，13和14上，与肉质相关的基因存在于染色体2，3，4，6，7，12和15上，与繁殖特性相关的基因存在于染色体4，6，7和8上。此外，还鉴别出了与产仔大小相关的候选基因ESR和PRLR、疾病抗性基因FUT1、皮毛颜色基因SLA、NRAMP和KIT，以及MSHR。
具体观察猪的主要特性，利用Wild Boar和Large White三代家族分析了重要的生长相关基因，该分析显示染色体4上背部脂肪和腹部脂肪的主要QTL占表型方差的20％。在染色体13上发现的生长QTL占表型方差的7％至12％。Andersson等人通过候选基因分析发现PRT1与背部脂肪和出生重量相关，其定位在染色体13的中部。猪的MHC位于染色体7上。近些年已经报道了MHC单模标本与一些性状之间的联系。利用MHC类的DNA探针已经部分证明了上述联系。最近，在中国杂交种的染色体7上发现QTL与生长和背部脂肪性状相关。显示出背部脂肪和出生重量的QTL位于靠近TNFA和S0102的区域。迄今为止的所有结果显示，该区域中至少存在一个生长和背部脂肪QTL。其它结果包括染色体6上的生长性状QTL，但它似乎与引起恶性高热的RYR1或RYR1周围的其它未知基因所产生的效果相关。已经报道了染色体3，6，8和14的一些类似的相关性。此外，Gerbens和Tepas已经报道心脏中的脂肪酸吸收蛋白和主要的遗传因子与平均日收益相关。包括Leptin CCK和CCKAR的其它候选基因已经被定位，可证实它们与食欲、脂肪和生长性状相关。
接下来与肉质性状相关的内容，已知PSE猪肉是由染色体6上的RYR1引发的。已经证明了其与几种肉质性状相关联，上述性状涉及来源于Pietrain背景的F2种群的PSE。对于与肉中糖元含量增加和pH降低相关的RN基因，将注意力集中在Hampshires。现在RN基因已经定位在染色体15上，位于侧面标记物(flanking markers)之间。Andersson及其同事利用191 F2动物上的234个标记物对肉质性状进行了最完整的QTL扫描之一，用于遗传作图。已经发现肉质性状(pH、水容积和色素沉着)的几个QTL位于染色体2和12上。Rothschild及其同事报道肉的颜色和坚实性评分与染色体4和7上的区域相关。已经报道了染色体7上与肉质性状的其它关联，染色体3与肌纤维的数量相关。已经显示肌肉中的一种脂肪生成酶-Malic酶的活性与染色体7上的SLA复合物相关。此外，还发现了与公猪性状相关的雄甾酮水平的主要QTL位于SLA复合物的区域。
在所研究的肌肉品质的候选基因中，HABP基因与肌肉内脂肪相关。发现许多基因与骨骼肌肌细胞生成素(myogenin)相关。
接下来，对于繁殖性状来说，为获得相关信息，需要大量种族资源以及大量的时间，因此难于进行该项研究，导致这些性状的QTL扫描结果受到限制。Wilkie等人报道了子宫长度和排卵速率的QTL，它们在不同的染色体位置上。Rathie等人报道了染色体8上与排卵速率相关的QTL，但是该报道与Wilkie及其同事观察的与排卵相关的QTL有一些不同。在Milan等人的French QTL实验中，发现增加猪仔大小的QTL位于Rathje所述的染色体8的同一位置上。有趣地，染色体8上与高排卵速率相关的QTL与绵羊中的Booroola基因定位在同一区域。令人感兴趣地，Short等人还发现该基因座对商用种系中产仔大小也有显著的作用。繁殖性QTL的有限的染色体QTL分析已经在染色体4，6，7，13和15中进行。已经明确证实雌激素基因与产仔大小显著相关。尽管根据品种的不同，基因的效果也有所不同，但在Meishan synthetics中，增加为1.15头猪/产仔，在Large White种系中增加为0.42头猪/产仔。更加近期的结果显示泌乳刺激素受体基因座与产仔大小显著相关。
最后，对于疾病抗性和免疫反应性状来说，迄今为止，对于疾病抗性或免疫反应QTL的QTL扫描还是很有限。已经鉴别了一些与免疫相关的QTL。氢化可的松水平的QTL也已经被定位在染色体7的末端位置，氢化可的松与紧张相关，而且可能与免疫反应相关。还鉴别了猪染色体6上的两个α基因FUT1和FUT2。Vgeli及其同事公开了一种具有多态性的标记物，在Large White，Landrace，Hampshire，Duroc以及Pietrain猪中该标记物与ECF18R紧密相连，而且在这些种群中，它可作为E.coli F18黏附抗性动物的辅助性选择的很好的标记物。近来有报道说，染色体7上的SLA复合物与Trichinella sporalis感染抗性相关，但与弓形体病抗性不相关。已知与小鼠中Salmonella免疫性试验的抗性相关的NRAMP1基因最近在猪染色体15上得到定位。已经在猪体内鉴别到的与人类疾病相关的基因包括凝血因子IX和高胆甾醇血基因。
结合前述，本发明人试图在猪体内发现具有经济特性的可用于基因改良的候选基因，即，将猪改良使之具有良好的生长性能、肉质、疾病抗性以及繁殖特性。
到目前为止，为检测猪体内的基因差别，已经使用了Northern印迹法、差异显示法(differential display)、基因表达的序列分析法以及点印迹法等多种mRNA水平的基因表达分析技术。然而，上述方法具有不适于同时分析大量表达产物的缺点。近来，已经发展出的一种新的cDNA微阵列技术，该技术可克服上述缺点。cDNA微阵列技术已经成为在多种活体内研究基因表达的强大手段之一。该技术被用于同时表达多个基因并大范围发现基因，以及用于基因DNA克隆的多态性筛选和图谱的制定。它是一种高度先进的RNA表达分析技术，用来定量分析由已知或未知基因转录的RNA。这种微阵列需要一种DNA芯片。根据待检测的核苷酸可将该基因芯片分成cDNA(200-500bp)芯片和寡核苷酸(15-100bp)芯片。此外，根据制备方法可将其分为机器打印芯片(robot printing chips)，例如针式微阵列，或者利用半导体生产程序的喷墨以及照相平板芯片。通过将ORF(开放阅读框架)的全长序列或者EST(表达序列标签)与载玻片(slide)连接，从而可利用cDNA芯片特别地区分出具有互补序列的基因。
发明内容
因此，本发明的目的之一就是提供一种cDNA芯片，该芯片包含固定在其上的探针，该探针用来检测在猪的肌肉和脂肪组织中特异性表达的标志基因，从而可被用于猪的改良以及猪基因的筛选和功能分析，其中该探针能够与该标志基因互补性结合。
本发明的另一目的是提供标志基因的表达谱，该标志基因与猪的经济的性状相关。
本发明的再一目的是将本发明的cDNA芯片用于根据猪的品种和组织来对基因表达进行比较，并可用于基因突变的筛选、基因多态性分析、以及将本发明的cDNA芯片用于开发疾病诊断和疾病治疗的新药。
根据本发明，上述目的可通过制备一探针DNA来完成，该探针DNA的制备包括从猪的肌肉和脂肪组织中抽提出RNA，然后利用该抽提出的RNA制备cDNA；克隆4434 ESTs并在数据库中分析和筛选核苷酸序列；利用PCR扩增ESTs；接下来分离并纯化，然后利用DNA芯片阵列在载玻片上用300个酵母控制的基因固定(点印)所得产物，从而制备DNA芯片；通过荧光物质与从猪的肌肉和脂肪组织中分离的总RNA相结合来制备靶DNA，将该靶DNA与所制备的探针DNA相杂交，然后扫描并分析图象文件，检测在肌肉和脂肪组织中特异性表达的基因谱。
本发明包含下述步骤从猪的肌肉和脂肪组织中制备ESTs，并鉴别其序列信息；利用PCR扩增ESTs，并分离和纯化；使用DNA芯片阵列在载玻片上固定ESTs；将荧光标记的靶DNA(ESTs)与探针DNA相杂交，其中所述的靶DNA是利用从猪的肌肉和脂肪组织中分离的总RNA来得到的；然后扫描并分析图象文件；接下来检测在猪的肌肉和脂肪组织中特异性表达的基因表达谱。
用于猪基因的筛选和功能分析的cDNA芯片通过下述步骤制备从猪的肌肉和脂肪组织中分离总RNA，以此制备cDNA；克隆其4434 ESTs，并分析、筛选数据库中所得的序列；利用PCR扩增ESTs，并分离和纯化；使用DNA芯片阵列在载玻片上点印4434 ESTs，从而制备该DNA芯片。
本发明的用于猪基因的筛选和功能分析的cDNA芯片包含探针和基底，该探针能够与标志基因的cDNA或RNA互补结合，该探针固定在基底上。
根据本发明，用于猪的筛选和功能分析的cDNA芯片的DNA微阵列上所固定的DNA探针包含4434 ESTs，该4434 ESTs是从猪的肌肉和脂肪组织中分离的。
基底优选是高分子膜，例如硅树脂晶片、玻璃、聚碳酸酯、薄膜、聚苯乙烯或聚亚胺酯。本发明的DNA微阵列可通过常规的制备DNA微阵列的方法将探针固定到基底上进行制备，所述的常规方法包括照相平板、压电影印、微吸量、以及点印等。在本发明中，利用点印的方法。
根据本发明，利用探针DNA所能检测到的标志基因包括与细胞结构和运动性相关的下列基因成分1-α动力蛋白重链、19kDa-关联蛋白3-类似物(19kDa-interacting protein 3-like)、肌动蛋白、肌动蛋白α-1、肌动蛋白γ-2、膜联蛋白A2、膜联蛋白V、膜联蛋白II、β-肌球蛋白重链mRNA、钙蛋白酶大分子多肽L2(calpain large polypeptide L2)、胶原蛋白、胶原蛋白α-1、胶原蛋白α-2、胶原蛋白α-V、果蝇虫盘大分子同源物5(Discs，large(Drosophila)homolog 5)、纤维连接蛋白、肝素硫酸蛋白多糖2、核纤层蛋白A/C(lamin A/C)、肌球蛋白、肌球蛋白重链、肌管素相关蛋白4、原骨胶原-脯氨酸、酸性分泌蛋白、原肌球蛋白、原肌球蛋白α链、肌钙蛋白C、微管蛋白β链和波形纤维蛋白(vimentin)，其中所述的探针DNA固定在对猪基因进行筛选和功能分析的cDNA芯片中的DNA微阵列上。
根据本发明，利用探针DNA所能检测的标志基因包括与代谢相关的下列基因成分醛缩酶A、碳酸脱水酶、细胞色素C、细胞色素C氧化酶业单元I、细胞色素C氧化酶、果糖-1、6-二磷酸酯酶、L-乳酸脱氢酶M链、LIM结构域1蛋白、NADH脱氢酶、NADH-泛醌氧化还原酶链1、NADH4L、辛基转移酶(COT)、磷酸精氨酸磷酸酯酶(phosphoargininephosphatase)、葡萄糖磷酸变位酶异构体2mRNA、蛋白-酪氨酸激酶、内酮酸激酶、sarcolipin、酪氨酸磷酸酶IVA型、UDP葡萄糖焦磷酸化酶、糖原磷酸化酶b和超氧化物岐化酶，其中所述的探针DNA固定在对猪基因进行筛选和功能分析的cDNA芯片中的DNA微阵列上。
根据本发明，利用探针DNA所能检测的标志基因包括与蛋白和基因表达相关的下列基因成分延伸因子1-α、延伸因子1-α1、烯醇酶3、DNA重复序列元件RPE-1、网状组织蛋白、核蛋白多肽B、核糖体蛋白、核糖体蛋白L18a、核糖体蛋白P0、转运RNA-Trp合成酶、翻译起始因子eif1、LIM结构域1蛋白和金属蛋白酶3组织抑制剂，其中所述的探针DNA固定在对猪基因进行筛选和功能分析的cDNA芯片中的DNA微阵列上。
根据本发明，利用探针DNA所能检测的标志基因包括与细胞信号和通讯相关的下列基因成分全部的线粒体DNA、线粒体、钾通道以及类似肌酸激酶，其中所述的探针DNA固定在对猪基因进行筛选和功能分析的cDNA芯片中的DNA微阵列上。
根据本发明，利用探针DNA所能检测的标志基因包括与细胞分裂相关的蛋白酶和半胱氨酸1(cystein 1)，其中所述的探针DNA固定在对猪基因进行筛选和功能分析的cDNA芯片中的DNA微阵列上。
根据本发明，利用探针DNA所能检测的标志基因包括与免疫反应相关的下列基因成分白细胞介素-2受体α链、Kel-样蛋白23和MHC I型SLA基因组区域，其中所述的探针DNA固定在对猪基因进行筛选和功能分析的cDNA芯片中的DNA微阵列上。
根据本发明，利用探针DNA所能检测的标志基因包括与生长相关的下列基因成分如SEQ ID NOs1至5所列的生长因子I，II，III，IV和V的核苷酸序列，其中所述的探针DNA固定在对猪基因进行筛选和功能分析的cDNA芯片中的DNA微阵列上。
本发明还提供了一种试剂盒，该试剂盒用来对猪基因进行筛选和功能分析，其包含cDNA芯片、结合Cy5-dCTP或Cy3-dCTP的cDNA，该cDNA是由待筛选组织的RNA制备的、以及荧光扫描系统和计算机分析系统。
利用本发明的对猪基因进行筛选和功能分析的cDNA芯片检测特定基因表达谱的方法，能够通过分析在某一类细胞内表达的标志基因来评价猪肉的质量。该方法还可利用检测出的猪生长特异性基因对猪的生长性能进行改良，从而用于猪品种的开发，还可通过鉴别与常规代谢和细胞疾病抗性的免疫反应相关的基因谱来进行猪的疾病诊断和药物开发。
具体实施例方式
现在将通过下述实施例对本发明进行详细解释。但是，下述解释并非为了对本发明作出限制。
实施例1猪基因的筛选和用于功能分析的cDNA芯片的构建为了制备用于对猪基因进行筛选和功能分析的cDNA芯片，采用下述方法制备探针DNA利用从Kagoshima Berkshire的肌肉和脂肪组织中分离的总RNA进行PCR得到4434 ESTs，然后对ESTs进行克隆，分析和筛选它们在数据库中的序列，利用PCR扩增ESTs，然后分离、纯化，接下来利用DNA芯片阵列将所得的产物固定在载玻片上，从而得到对猪基因进行筛选和功能分析的cDNA芯片。
制备实施例1探针DNA的制备和排列首先，制备探针DNA，并将其连接到载玻片上，该探针DNA是通过PCR扩增的cDNA。利用RNA提取试剂盒(Qiagen，德国)按照说明书从Kagoshima Berkshire(体重30kg和90kg)的背最长肌的肌肉和脂肪组织中提取总RNA，并用oligo(dT)柱提取mRNA。提取出的mRNA样品利用SP6、T3正向引物、T7反向引物(Amersham Pharmacia Biotech，England)进行RT-PCR，从而合成cDNA。每一PCR反应物的总体积是100μl。分别将100pM的正向引物和反向引物转移至96孔PCR板(Genetics，England)中。每孔包含2.5mM dNTP、10×PCR缓冲液、25mM MgCl2、0.2μg DNA模板、2.5单位Taq聚合酶。在GeneAmp PCR system5700(AB Applied BioSystem，Canada)中进行PCR，PCR条件为94℃下30秒，58℃下45秒，72℃下1分钟，共30个循环。
扩增的DNA的大小通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴别。在96孔板中用乙醇沉淀PCR产物，然后干燥，储存于-20℃。
对按上述方法制备的总4434 cDNAs(ESTs)进行克隆，分析猪所具有的基因的核苷酸序列，从NCBI的数据库鉴定它们的基因信息。分离具有信息的基因并利用PCR进行纯化。构建总4434 cDNAs(ESTs)的基因座和图谱。将总4434 cDNAs(ESTs)和300个酵母控制基因排列在1.7cm2的面积上。然后，显微镜(Corning制造)下将探针DNA点印到载玻片上，采取Microgrid II(Biorobotics)用CMT-GAPSTM氨基硅烷进行包被。利用一开口针(split pin)将探针DNA打印到Microgrid II上。该针样装置靠近板孔，将溶液注射进载玻片(1至2nL)。探针DNA打印完成后，干燥载玻片，利用Stratalinker TM(Stratagene，USA)使点印的DNA和载玻片在90mJ进行UV交联，在室温下用0.2％SDS洗涤2次，共2分钟，然后在室温下用三蒸水洗涤1次，共1分钟。洗涤完毕后，将载玻片浸入95℃的水槽2分钟，通过加入封闭溶液(1.0g的NaBH4溶解于300mL磷酸盐缓冲液(pH7.4)和100mL无水乙醇的混合物)封闭15分钟。然后，将载玻片在室温下用0.2％SDS洗涤3次，共1分钟，再在室温下用三蒸水洗涤1次，共2分钟，在空气中晾干。
利用从猪的肌肉和脂肪组织制备的探针DNA能够检测的标志基因如下所述
1)细胞结构和运动性相关的基因1-α动力蛋白重链、19kDa-关联蛋白3-类似物(19kDa-interactingprotein 3-like)、肌动蛋白、肌动蛋白α-1、肌动蛋白γ-2、膜联蛋白A2、膜联蛋白V、膜联蛋白II、β-肌球蛋白重链mRNA、钙蛋白酶大分子多肽L2(calpain large polypeptide L2)、胶原蛋白、胶原蛋白α-1、胶原蛋白α-2、胶原蛋白α-V、果蝇虫盘大分子同源物5、纤维连接蛋白、肝素硫酸蛋白多糖2、核纤层蛋白A/C、肌球蛋白、肌球蛋白重链、肌管素相关蛋白4、原骨胶原-脯氨酸、酸性分泌蛋白、原肌球蛋白、原肌球蛋白α链、肌钙蛋白C、微管蛋白β链和波形纤维蛋白(vimentin)。
2)代谢相关的基因醛缩酶A、碳酸脱水酶、细胞色素C、细胞色素C氧化酶亚单元I、细胞色素C氧化酶、果糖-1、6-二磷酸酯酶、L-乳酸脱氢酶M链、LIM结构域1蛋白、NADH脱氢酶、NADH-泛醌氧化还原酶链1、NADH4L、辛基转移酶(COT)、磷酸精氨酸磷酸酯酶(phosphoarginine phosphatase)、葡萄糖磷酸变位酶异构体2mRNA、蛋白-酪氨酸激酶、丙酮酸激酶、sarcolipin、酪氨酸磷酸酶IVA型、UDP葡萄糖焦磷酸化酶、糖原磷酸化酶b和超氧化物岐化酶。
3)基因和蛋白表达相关的基因延伸因子1-α、延伸因子1-α1、烯醇酶3、DNA重复序列元件RPE-1、网状组织蛋白、核蛋白多肽B、核糖体蛋白、核糖体蛋白L18a、核糖体蛋白P0、转运RNA-Trp合成酶、翻译起始因子eif1、LIM结构域1蛋白和金属蛋白酶3组织抑制剂。
4)细胞信号和通讯相关的基因全部的线粒体DNA、线粒体、钾通道以及类似肌酸激酶。
5)细胞分裂相关基因蛋白酶和半胱氨酸1(cystein1)。
6)免疫反应相关基因白细胞介素-2受体α链、Kel-样蛋白23和MHC I型SLA基因组区域(MHC class I SLA genomic region)。
7)生长相关基因生长因子I，II，III，IV和V的核苷酸序列，如SEQ ID NOs1至5所列8)其它cDNA flj13323 fis、KIAA0182蛋白、KIAA1096蛋白、AC015998、AR078G0liTHYEG01S、Cn26h08.x1、COI、DJ466P17.1.1(Laforin)、foocen-m、HWM012cA.1、假设的蛋白质、mandarina文库、MARC1PI、MARC 2PIG、MR1-AN0039-290800-004-a01、NIH_MGC_4、NIH_MGC_65、NIH_MGC_77、NIH_MGC_77、外周血细胞cDNA文库、假定的蛋白(putative)、衣藻(reinhardtii)CC-1690、小肠cDNA文库、胸腺素β-4mRNA、未知(unknown)、未命名的(unnamed)蛋白产物、染色体14DNA序列、整合素β-1亚单位、衣藻(reinhardtii)CC-1690。
实验性实施例1利用本发明的cDNA芯片筛选组织特异性基因的表达谱利用实施例1中制备的cDNA芯片对在猪的肌肉和脂肪组织中特异性表达的基因表达谱进行检测。从体重30kg和90kg的KagoshimaBerkshires的背最长肌区域取肌肉组织。从体重30kg的KagoshimaBerkshires中取脂肪组织。将肌肉和脂肪组织切成5～8mm长，冷冻在液氮中，保存于-70℃。
按照TrizolTM试剂盒(Life Technologies，Inc.)的说明书的方法从0.2至1.0g实验组和对照组中分离总RNA，以此来制备靶DNA。每50至100mg组织中加入1mL TrizoTM，然后用glass-Teflon或Polytron的匀浆器研磨。将研磨后的颗粒在12,000g、4℃下离心10分钟，将1mL上清液等分。在所分的每一份中加入200μl氯仿，震荡15秒，置冰上15分钟，在12,000g、4℃下离心10分钟，然后再向其中加入同量的氯仿，震荡15秒，置冰上15分钟，在12,000g、4℃下离心10分钟。将上清液转移至一新管中。向管中加入500μl异丙醇，震荡并置冰上15分钟。在12,000g、4℃下离心5分钟。移出上清液，与1mL 75％冰冷的乙醇混合，在12,000g、4℃下离心5分钟。移出上清液，在净化台上冷冻干燥30分钟，将其加到20μl不含RNase的水或DEPC水中以溶解RNA。将总RNA的浓度调整至40μg/17μl，以备电泳。
利用标准的第一链cDNA合成的方法制备靶DNA。简言之，根据Schuler(1996)所述的方法，取40μg的总RNA，与oligo dT-18mer引物(Invitrogen Life Technologies)混合，在65℃加热10分钟，然后在4℃冷却5分钟。然后，向其中加入1μl的下述混合物25mM dATP、dGTP和dTTP、1μl的1mM dCTP(Promega)、2μl的1mM氰蓝3-dCTP或2μl的1mM氰蓝5-dCTP、20单位的RNase抑制剂(Invitrogen LifeTechnology)、100单位的M-MLV Rtase、2μl的10×第一链缓冲液，并用吸液管混匀。将反应混合物在38℃温育2小时，利用乙醇沉淀法除去未结合的核苷酸。此处使用DEPC处理水。
将上述制备的载玻片用杂交溶液(5×SSC，0.2％SDS，1mg/mL鲱鱼精DNA)在65℃预杂交1小时。将靶DNA用氰蓝3(Cy-3)和氰蓝5(Cy-5)标记，重悬于20μl的杂交溶液中，在95℃变性2分钟。然后，将载玻片用该溶液在65℃杂交过夜。杂交在盖有防护玻璃罩(Grace Bio-Lab)的潮湿箱中进行。
杂交后，在室温下用2×SSC、0.1％SDS洗涤载玻片4次，共5分钟，同时用震荡器剧烈搅拌。然后在室温下用0.2×SSC洗涤载玻片1次、共5分钟，用0.1×SSC洗涤载玻片1次，5分钟。
将载玻片在ScanArray 5000(GSI Lumonics Version 3.1)上用50μm象素尺寸进行扫描。用氰蓝3-dCTP标记的靶DNA在565nm处扫描到，用氰蓝5-dCTP标记的靶DNA在670nm处扫描到。通过氰蓝3-dCTP-和氰蓝5-dCTP-标记点的线性扫描制作两种荧光强度的标准曲线。将载玻片在Scanarray 4000XL上用10μm象素尺寸再次进行扫描。在Quantarray软件2.1版本上对所得的TIFF图像文件进行分析，自动去除背景。将每一点的强度在Quantarray上转化为Microsoft Excel数据。
将在猪的肌肉和脂肪组织中早期表达的ESM(早期肌肉)基因的全部表达模式与在成熟期表达的ASM(成熟期肌肉)基因和在早期表达的ESF(早期脂肪)基因的表达模式相比较。表1显示了“ESM-特异性”和“ASM-特异性”基因，表2显示了“ESF-特异性”基因。与ESM相比，ASM中有20个基因显示了增高5倍的表达水平。而且，与ESM相比，ESF中有18个基因显示了增高5至10倍的表达水平，与ASM相比，ESM中有18个基因显示了增高5至10倍的表达水平。
还发现在猪的肌肉和脂肪组织中特异性表达的下述5个生长特异性基因。
1.GF(生长因子)I基因SEQ ID NO 1gagaccagca aatactatgt gaccatcatt gatgccccag gacacagaga cttcatcaaa 60aacatgatta caggcacatc ccaggctgac tgtgctgtcc tgattgttgc tgctggtgtt 120ggtgaatttg aagctggtat ctccaagaac gggcagaccc gcgagcatgc tcttctggct 180tacaccctgg gtgtgaaaca gctgattgtt ggtgtcaaca aaatggattc caccgagcca 240ccatacagtc agaagagata cgaggaaatc gttaaggaag tcagcaccta cattaagaaa 300attggctaca accctgacac agtagcattt gtgccaattt ctggttggaa tggtgacaac 360atgctggagc caagtgctaa tatgccttgg ttcaagggat ggaaagtcac ccgcaaagat 420ggcagtgcca gtggcaccac gctgctggaa gctttggatt gtatcctacc accaactcgt 480ccaactgaca agcctctgcg actgcccctc caggatgtct ataaaattgg aggcattggc 540actgtccctg tgggccgagt ggagactggt gttctcaaac ctggcatggt ggttaccttt 600gctccagtca atgtaacaac tgaagtcaag tctgttgaaa tgcaccatga agctttgagt2.GF(生长因子)II基因SEQ ID NO 2gctgactgat cgggagaatc agtctatctt aatcaccgga gaatccgggg caggaaagac 60tgtgaacacg aagcgtgtca tccagtactt tgccacaatc gccgtcactg gggagaagaa 120gaaggaggaa cctactcctg gcaaaatgca ggggactctg gaagatcaga tcatcagtgc 180caaccccctg ctcgaggcct ttggcaacgc caagaccgtg aggaacgaca actcctctcg 240ctttggtaaa ttcatcagga tccacttcgg taccactggg aagctggctt ctgctgacat 300cgaaacatat cttctagaga agtctagagt cactttccag ctaaaggcag aaagaagcta 360ccacattttt tatcagatca tgtctaacaa gaagccagag ctcattgaaa tgctcctgat 420caccaccaac ccatatgact acgccttcgt cagtcaaggg gagatcactg tccccagcat 480tgatgaccaa gaggagctga tggccacaga tagtgccatt gaaatcctgg3.GF(生长因子)III基因SEQ ID NO 3gttgttcctt taaatatgat gttgccacaa gctgcattgg agactcattg cagtaatatt 60
tccaatgtgc cacctacaag agagatactt caagtctttc ttactgatgt acacatgaag 120gaagtaattc agcagttcat tgatgtcctg agtgtagcag tcaagaaacg tgtcttgtgt 180ttacctaggg atgaaaacct gacagcaaat gaagttttga aaacgtgtga taggaaagca 240aatgttgcaa tcctgttttc tgggggcatt gattccatgg ttattgcaac ccttgctgac 300cgtcatattc ctttagatga accaattgat cttcttaatg tagctttcat agctgaagaa 360aagaccatgc caactacctt taacagagaa gggaataaac agaaaaataa atgtgaaata 420ccttcagaag aattctctaa agatgttgct gctgctgctg ctgacagtcc taataaacat 480tcagtgtacc agatcgaatc acaggaaggg cgggactaaa ggaactacaa gctgttagc4.GF(生长因子)IV基因SEQ ID NO 4catttatgag ggctacgcgc tgccgcacgc catcatgcgc ctggacctgg cgggccgcga 60tctcaccgac tacctgatga agatcctcac tgagcgtggc tactccttct gaccacagct 120gagcgcgaga tcgtgcgcga catcaaggag aagctgtgct acgtggccct ggacttcgag 180aacgagatgg cgacggccgc ctcctcctcc tccctggaaa agagctacga gctgccagac 240gggcaggtca tcaccatcgg caacgagcgc ttccgctgcc cggagacgct cttccagccc 300tccttcatcg gtatggagtc ggcgggcatt cacgagacca cctacaacag catcatgaag 360tgtgacatcg acatcaggaa ggacctgtat gccaacaacg tcatgtcggg gggcaccac5.GF(生长因子)V基因SEQ ID NO 5tatatagaac cgaatcacgt acactgggcc tgaccaagca gggccaaaac aaggcaacct 60aggaggttat aaaataggta tacgcgcgct gacacataca tactcactac ccgaacgcgg 120ggacaactag ggctccgcca taagccatcc tttcctggtc gtcgatgttg cgggctgcag 180ttatagggct gccaaccgcc atacacacct taccagccac ttattaagtt acatccacga 240gggctctgta ccacccctaa gcagtggcag tggtagccgc tgcccgctta ccctgcgcag 300tgttggtgct agctccgtcc taagcttccc cgatagccgc cgctttttac acaccatcgg 360cggactagac accgttggtt gcagcgtaag cgtctatggt agcagctgcg gcgaccgccg 420tgtagccagc ttactacatg ttagtttcag caaccaccct gccaataccc gtgttcccta 480ctccaactct gtcggtttca gccgcag表1
在ESM和ASM中分别表达的基因的表达比率
一致的登录号**与数据库一致的信息没有匹配与数据库没有一致的信息；新的ESTESM早期肌肉(体重30kg)，ASM成熟期肌肉(体重90kg)，SM猪的肌肉表2在ESM和ESF中分别表达的基因的表达比率
一致的登录号**与数据库一致的信息没有匹配与数据库没有一致的信息；新的ESTESM早期肌肉(体重30kg)，ESF早期脂肪(体重30kg)，SM猪的肌肉由上述结果可知，本发明人利用本发明的用于对猪基因进行筛选和功能分析的cDNA证明了在猪的肌肉和脂肪组织特异性表达的基因的表达谱，并且利用该特性可对肉的品质进行改良和评估。我们还鉴定了生长相关因子的核苷酸序列，并将其用于猪种改良，获得良好的生长性能。此外，利用本发明的cDNA芯片预计还可能根据猪的品种和组织来筛选和比较表达谱，并可进行基因突变的筛选、遗传多态性的分析、以及用于疾病诊断和疾病治疗的新药的开发。
实施例2用于对猪基因进行筛选和功能分析的试剂盒构建制备用于对猪基因进行筛选和功能分析的试剂盒，其包含实施例1中制备的cDNA芯片、结合了Cy5-dCTP或Cy3-dCTP的cDNA，该cDNA是由待筛选组织的RNA制备的、以及荧光扫描系统和计算机分析系统。
工业实用性如实施例所述，本发明涉及对猪基因进行筛选和功能分析的cDNA芯片，并提供了一种cDNA芯片，该芯片包含探针，所述探针用于检测在猪的肌肉和脂肪组织中特异性表达的标志基因，该探针能够与标志基因互补结合。此外，本发明还使用cDNA芯片提供了与猪的经济特性相关的标志基因的表达谱。因此，本发明的cDNA芯片能用来根据猪的品种和组织来对基因表达谱进行比较，并可用于基因突变的筛选、遗传多态性的分析、以及用于疾病诊断和疾病治疗的新药开发和猪种改良，因此，本发明是一种对遗传工程工业非常有用的发明。
PIF040402c-sequence list.txtSEQUENCE LISTING<110>庆尚南道金哲旭<120>用于对猪体内特定基因进行筛选及功能分析的cDNA芯片<130>PIF040402C<150>KR 2003-83651<151>2003-11-24<160>5<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>660<212>DNA<213>Kagoshima Berkshire<400>1gagaccagca aatactatgt gaccatcatt gatgccccag gacacagaga cttcatcaaa 60aacatgatta caggcacatc ccaggctgac tgtgctgtcc tgattgttgc tgctggtgtt 120ggtgaatttg aagctggtat ctccaagaac gggcagaccc gcgagcatgc tcttctggct 180tacaccctgg gtgtgaaaca gctgattgtt ggtgtcaaca aaatggattc caccgagcca 240ccatacagtc agaagagata cgaggaaatc gttaaggaag tcagcaccta cattaagaaa 300attggctaca accctgacac agtagcattt gtgccaattt ctggttggaa tggtgacaac 360atgctggagc caagtgctaa tatgccttgg ttcaagggat ggaaagtcac ccgcaaagat 420ggcagtgcca gtggcaccac gctgctggaa gctttggatt gtatcctacc accaactcgt 480ccaactgaca agcctctgcg actgcccctc caggatgtct ataaaattgg aggcattggc 540actgtccctg tgggccgagt ggagactggt gttctcaaac ctggcatggt ggttaccttt 600gctccagtca atgtaacaac tgaagtcaag tctgttgaaa tgcaccatga agctttgagt 660<210>2<211>530<212>DNA<213>Kagoshima Berkshire<400>2gctgactgat cgggagaatc agtctatctt aatcaccgga gaatccgggg caggaaagac 60tgtgaacacg aagcgtgtca tccagtactt tgccacaatc gccgtcactg gggagaagaa 120gaaggaggaa cctactcctg gcaaaatgca ggggactctg gaagatcaga tcatcagtgc 180caaccccctg ctcgaggcct ttggcaacgc caagaccgtg aggaacgaca actcctctcg 240ctttggtaaa ttcatcagga tccacttcgg taccactggg aagctggctt ctgctgacat 300cgaaacatat cttctagaga agtctagagt cactttccag ctaaaggcag aaagaagcta 360ccacattttt tatcagatca tgtctaacaa gaagccagag ctcattgaaa tgctcctgat 420caccaccaac ccatatgact acgccttcgt cagtcaaggg gagatcactg tccccagcat 480tgatgaccaa gaggagctga tggccacaga tagtgccatt gaaatcctgg530<210>3<211>589<212>DNA<213>Kagoshima Berkshire
PIF040402c-sequence list.txt<400>3gttgttcctt taaatatgat gttgccacaa gctgcattgg agactcattg cagtaatatt 60tccaatgtgc cacctacaag agagatactt caagtctttc ttactgatgt acacatgaag 120gaagtaattc agcagttcat tgatgtcctg agtgtagcag tcaagaaacg tgtcttgtgt 180ttacctaggg atgaaaacct gacagcaaat gaagttttga aaacgtgtga taggaaagca 240aatgttgcaa tcctgttttc tgggggcatt gattccatgg ttattgcaac ccttgctgac 300cgtcatattc ctttagatga accaattgat cttcttaatg tagctttcat agctgaagaa 360aagaccatgc caactacctt taacagagaa gggaataaac agaaaaataa atgtgaaata 420ccttcagaag aattctctaa agatgttgct gctgctgctg ctgacagtcc taataaacat 480tcagtgtacc agatcgaatc acaggaaggg cgggactaaa ggaactacaa gctgttagct 540gatgaccaag aggagctgat ggccacagat agtgccattg aaatcctgg 589<210>4<211>469<212>DNA<213>Kagoshima Berkshire<400>4catttatgag ggctacgcgc tgccgcacgc catcatgcgc ctggacctgg cgggccgcga 60tctcaccgac tacctgatga agatcctcac tgagcgtggc tactccttct gaccacagct 120gagcgcgaga tcgtgcgcga catcaaggag aagctgtgct acgtggccct ggacttcgag 180aacgagatgg cgacggccgc ctcctcctcc tccctggaaa agagctacga gctgccagac 240gggcaggtca tcaccatcgg caacgagcgc ttccgctgcc cggagacgct cttccagccc 300tccttcatcg gtatggagtc ggcgggcatt cacgagacca cctacaacag catcatgaag 360tgtgacatcg acatcaggaa ggacctgtat gccaacaacg tcatgtcggg gggcaccact 420gatgaccaag aggagctgat ggccacagat agtgccattg aaatcctgg 469<210>5<211>507<212>DNA<213>Kagoshima Berkshire<400>5tatatagaac cgaatcacgt acactgggcc tgaccaagca gggccaaaac aaggcaacct 60aggaggttat aaaataggta tacgcgcgct gacacataca tactcactac ccgaacgcgg 120ggacaactag ggctccgcca taagccatcc tttcctggtc gtcgatgttg cgggctgcag 180ttatagggct gccaaccgcc atacacacct taccagccac ttattaagtt acatccacga 240gggctctgta ccacccctaa gcagtggcag tggtagccgc tgcccgctta ccctgcgcag 300tgttggtgct agctccgtcc taagcttccc cgatagccgc cgctttttac acaccatcgg 360cggactagac accgttggtt gcagcgtaag cgtctatggt agcagctgcg gcgaccgccg 420tgtagccagc ttactacatg ttagtttcag caaccaccct gccaataccc gtgttcccta 480ctccaactct gtcggtttca gccgcag 50权利要求
1.一种对猪的基因进行筛选和功能分析的cDNA芯片，该芯片包含探针和固定探针的基底，所述探针能够检测在猪的肌肉和脂肪组织中特异性表达的标志基因。
2.权利要求1的cDNA芯片，其中，所述探针包含4434 ESTs，该4434 ESTs来源于猪的肌肉和脂肪组织，并作为标志基因。
3.权利要求1的cDNA芯片，其中，利用该探针检测到的与细胞结构和运动性相关的标志基因包含1-α动力蛋白重链、19kDa-关联蛋白3-类似物、肌动蛋白、肌动蛋白α-1、肌动蛋白γ-2、膜联蛋白A2、膜联蛋白V、膜联蛋白II、β-肌球蛋白重链mRNA、钙蛋白酶大分子多肽L2、胶原蛋白、胶原蛋白α-1、胶原蛋白α-2、胶原蛋白α-V、果蝇虫盘大分子同源物5、纤维连接蛋白、肝素硫酸蛋白多糖2、核纤层蛋白A/C、肌球蛋白、肌球蛋白重链、肌管素相关蛋白4、原骨胶原-脯氨酸、酸性分泌蛋白、原肌球蛋白、原肌球蛋白α链、肌钙蛋白C、微管蛋白β链和波形纤维蛋白。
4.权利要求1的cDNA芯片，其中，利用该探针检测到的与代谢相关的标志基因包含醛缩酶A、碳酸脱水酶、细胞色素C、细胞色素C氧化酶亚单元I、细胞色素C氧化酶、果糖-1、6-二磷酸酯酶、L-乳酸脱氢酶M链、LIM结构域1蛋白、NADH脱氢酶、NADH-泛醌氧化还原酶链1、NADH4L、辛基转移酶、磷酸精氨酸磷酸酯酶、葡萄糖磷酸变位酶异构体2mRNA、蛋白-酪氨酸激酶、丙酮酸激酶、sarcolipin、酪氨酸磷酸酶IVA型、UDP葡萄糖焦磷酸化酶、糖原磷酸化酶b和超氧化物岐化酶。
5.权利要求1的cDNA芯片，其中，利用该探针检测到的与蛋白和基因表达相关的标志基因包含延伸因子1-α、延伸因子1-α1、烯醇酶3、DNA重复序列元件RPE-1、网状组织蛋白、核蛋白多肽B、核糖体蛋白、核糖体蛋白L18a、核糖体蛋白P0、转运RNA-Trp合成酶、翻译起始因子eif1、LIM结构域1蛋白和金属蛋白酶3组织抑制剂。
6.权利要求1的cDNA芯片，其中，利用该探针检测到的与细胞信号和通讯相关的标志基因包含全部的线粒体DNA、线粒体、钾通道和类似肌酸激酶。
7.权利要求1的cDNA芯片，其中，利用该探针检测到的与细胞分裂相关的标志基因包含蛋白酶和半胱氨酸1。
8.权利要求1的cDNA芯片，其中，利用该探针检测到的与免疫反应相关的标志基因包含白细胞介素-2受体α链、Kel-样蛋白23和MHC I型SLA基因组区域。
9.权利要求1的cDNA芯片，其中，利用该探针检测到的与生长相关的标志基因包含如SEQ ID NOs1至5所列的生长因子I，II，III，IV和V的核苷酸序列。
10.用于对猪基因进行筛选和功能分析的试剂盒，该试剂盒包含权利要求1所定义的cDNA芯片。
全文摘要
本发明涉及对猪基因进行筛选和功能分析的cDNA芯片，并提供了一种cDNA芯片，该芯片包含探针，所述探针用于检测在猪的肌肉和脂肪组织中特异性表达的标志基因，该探针能够与标志基因互补结合。此外，本发明还使用cDNA芯片提供了与猪的经济特性相关的标志基因的表达谱。因此，本发明的cDNA芯片能用来根据猪的品种和组织来对基因表达谱进行比较，并可用于基因突变的筛选、遗传多态性的分析、以及用于疾病诊断和疾病治疗的新药开发和猪种改良。
文档编号C40B60/14GK1621531SQ20041000752
公开日2005年6月1日 申请日期2004年3月12日 优先权日2003年11月24日
发明者金哲旭, 吕政秀, 李正圭, 宋瑛敏, 曹光根, 郑起和, 金一锡, 阵祥根, 朴修贤, 郑智媛, 李旼晶, 权银贞, 赵恩锡, 赵碻来, 慎诜敏, 南喜善, 洪娟喜, 洪星光, 姜阳守, 河永主, 卢正晚, 郭石俊, 崔仁灏, 金炳宇 申请人:庆尚南道, 金哲旭