技术领域本申请属于植物病毒检测技术领域，具体涉及一种检测仙人掌X病毒所用PCR引物对及其应用专利申请。
背景技术：
火龙果是仙人掌科量天尺属（或蛇鞭柱属）一种典型的热带水果植物，其性喜温暖潮湿，耐炎热，抗病力强；果实红色艳丽，果肉口感好，甜而不腻，清淡中带有芳香；营养丰富，除碳水化合物、粗纤维外，还含有不饱和脂肪酸、抗氧化物质、维生素B族、胡萝卜素、叶绿素以及矿物质钙、磷、铁等，具有高纤维、低脂肪、低热量等特点。此外，火龙果尤其是红肉和紫肉品种的果肉富含花青素，以及有较其他水果丰富的水溶性膳食纤维和植物蛋白，可预防便秘、降低血糖、血脂，并具解毒、润肺、养颜等保健功效，是果品市场上的优新品种，也是发展绿色食品的最佳水果品种之一。火龙果原产于中美洲，我国大陆地区在上世纪90年代后期才开始引种试种火龙果，至2010年，全国种植面积（除台湾）仅约3.53万亩，其中广西约2.40万亩、海南省约0.98万亩、广东约0.30万亩、贵州约0.68万亩、其他产区（福建、云南等省）约0.30万亩（邓仁菊等，国内外火龙果研究进展及产业发展现状，贵州农业科学，2011）。由于市场需求旺盛，火龙果产业近年来发展迅速，据贵州省农科院报道，至2014年初，全国面积（除台湾）已达26万亩，主要分布在贵州、广西、海南、广东和云南等省份。海南作为我国唯一一个全境处于热带亚热带的省份，拥有得天独厚的地理和气候优势，目前已成为我国品种最丰富、种类最多、产量较大的热带水果生产基地，火龙果产业发展潜力巨大。然而，随着火龙果大力引种到中国，病毒病也随之到来和爆发。火龙果上的病毒病一直是世界上火龙果生产和种植的主要限制因素之一，其中仙人掌X病毒（CactusvirusX，CVX）是引起火龙果严重病害的重要病毒，导致火龙果产量下降和品质变劣。而针对该病毒，目前尚缺少较为有效的治疗措施，一旦该病毒病流行，就会造成惨重经济损失，目前主要以预防为主。由于仙人掌X病毒在中国境内（除台湾）仅是最近几年才有所报道，针对该病毒的检测方法尚待建立。
技术实现要素：
本发明目的在于提供一种检测仙人掌X病毒所用PCR引物，并以此引物为基础提供了一种火龙果上仙人掌X病毒的检测方法。本申请所采取的技术方案详述如下。一种检测仙人掌X病毒所用PCR引物，具体为：上游引物CVX-CPF：如SEQIDNO.1所示，即，5’-CAGTCCGCCGGACCCCG-3’，下游引物CVX-CPR：如SEQIDNO.2所示，即，5’-AGACTCTGAACCTTGGAGCCCC-3’。所述检测仙人掌X病毒所用PCR引物在判定仙人掌X病毒中的应用，可用于检测确定火龙果或仙人掌中是否受到仙人掌X病毒（CVX）的侵染。利用所述检测仙人掌X病毒所用PCR引物，检测火龙果上仙人掌X病毒的检测方法，包括如下步骤：（1）提取待检火龙果样品的总RNA，备用；提取总RNA具体步骤参考如下：A．取待检火龙果样品0.2g置于研钵中，液氮冷冻后，研磨成粉末，并将研磨后的粉末转入1.5mL离心管中；B．于步骤A的离心管中加入1mL65℃预热的2×CTAB缓冲液，混匀后，65℃温育10min；C．加入500μL氯仿/异戊醇（体积比，24:1），混匀后4℃，12000r/min离心10min；D．取上清，加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1），混匀后4℃，12000r/min离心10min；E．取上清，加入预冷的2倍体积无水乙醇，-20℃放置30min；F．4℃、12000r/min离心15min，弃上清，沉淀用50μL无RNA酶去离子水溶解沉淀，-20℃保存备用，此即为所提取的总RNA样品；同样操作，设置阳性对照，所述阳性对照为受CVX病毒感染的火龙果样品；（2）按照北京全式金生物科技有限公司的EasyScriptOne-StepRT-PCRSuperMix试剂盒，以第（1）步中所提取的总RNA为模板，利用所述PCR引物对（即上游引物CVX-CPF和下游引物CVX-CPR），进行RT-PCR扩增；20μL扩增体系设计如下：步骤（1）中所提取总RNA，2μL（总RNA以质量用量计，1μg）；EasyScriptOne-StepEnzymeMix，0.4μL；上游引物CVX-CPF，0.4μL（10μM）；下游引物CVX-CPR，0.4μL（10μM）；2×One-StepReactionMix，10μL；无RNA酶去离子水，加至20μL；反应程序为：先50℃反转录30min；然后94℃变性3min；再94℃、30sec，56℃、1min，72℃、1min，共35个循环；最后72℃、10min；同样操作，对阳性对照样品进行RT-PCR扩增；（3）对步骤（2）中PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，与阳性对照相比，若待检样品的扩增条带的长度为600bp左右，与阳性对照类似，则待检样品呈阳性，表明样品中含有仙人掌X病毒；（4）为进一步确定是否受CVX病毒侵染，优选情况下，可将步骤（3）中待检样品的PCR扩增产物直接连于pMD18T载体，转化大肠杆菌，挑取阳性克隆进行菌液PCR初步鉴定，对鉴定为阳性的菌株进一步测序，依据测序结果进行比对，以确定是否受仙人掌X病毒的侵染。本发明所提供的PCR引物具有一定的检测CVX的通用性，不仅可以检测火龙果上的CVX病毒，还可以检测仙人掌中的CVX病毒。而且利用该引物扩增所得的目的产物在3’端附加有一个A碱基，便于直接克隆到T-vector中用于进一步的测序或研究，因而具有较好的实用性。同时，本发明所提供的检测火龙果上CVX病毒的检测方法，其反转录和PCR扩增一步完成，可大幅度降低交叉污染的几率，同时使得检测效率大幅度提高。实际实验表明，利用本发明检测火龙果或仙人掌中的仙人掌X病毒（CVX），其操作较为简单方便，而且具有较高检测灵敏度，可以检测到约1pg。总体而言，本发明所提供的PCR引物及所提供的CVX病毒检测方法，对于规范化、标准化CVX的检测具有十分重要的应用价值，同时也为该病毒的预防奠定了一定的前期检测基础和科学依据，因而具有较好地实用价值。附图说明图1为提取火龙果总RNA后的电泳图，其中，M：2000bpDNAmarker；CK+，阳性对照；1~10为，待检测样品；CK-，空白对照。图2为RT-PCR法检测火龙果样品仙人掌X病毒（CVX）的凝胶电泳图；其中，M：2000bpDNAmarker；CK+，阳性对照；1~10为，待检测样品；CK-，空白对照。图3为待检1号火龙果样品检测出的CVX病毒外壳蛋白基因序列在NCBIblastn比对后的结果。具体实施方式下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，对本发明中所涉及部分物料情况简要介绍如下。生物材料样品：待检的10个样品为疑似受到CVX病毒侵染前期的火龙果样品，其采自海南省农业科学院澄迈基地，其生理病症表现为：轻微褪绿色（不明显）或无明显的生理病症；阳性对照样品（CK+），即受到CVX病毒侵染后期的火龙果样品，采自海南省农业科学院澄迈基地，火龙果病样具有明显的褪绿或绿色小斑点症状；该阳性对照经进一步鉴定后，确认为受CVX病毒感染，具体可参见：（PengC.etal,MolecularidentificationofCactusvirusXinfectingHylocereuspolyrhizus(Cactaceae)inHainanIsland，China,2016,PlantDisease,DOI:10.1094/PDIS-01-16-0048-PDN）；pMD18-T载体，宝生物工程(大连)有限公司；上下游引物合成及测序，由英潍捷基（上海）贸易有限公司完成；实验仪器及试剂：凝胶电泳仪，北京市六一仪器厂；无RNA酶去离子水，生工生物工程(上海)股份有限公司；EasyScriptOne-StepRT-PCRSuperMix，北京全式金生物科技有限公司；CTAB缓冲液：成分为，2%CTAB，100mmol/LTris-HCl(pH8.0)，1.4mol/LNaCl，20mmol/LEDTA(pH8.0)，2%β－巯基乙醇；配制时，按照所配缓冲液的体积和不同试剂的浓度，计算不同试剂的用量，加入适量的H2O，温水浴条件下磁力搅拌溶解后，加水定容到所需体积，高压灭菌。实施例1本实施例所提供的检测火龙果上仙人掌X病毒的检测方法，包括如下步骤：（1）提取待检火龙果样品和病样的总RNA，备用；提取总RNA具体步骤如下：A．取待检火龙果样品0.2g置于研钵中，液氮冷冻后（8~10s），研磨成粉末，并将研磨后粉末转入1.5mL离心管中；B．于步骤A的离心管中加入1mL65℃预热的2×CTAB缓冲液，混匀后，65℃温育10min；C．加入500μL氯仿/异戊醇（体积比，24:1），混匀后4℃，12000r/min离心10min；D．取800μL上清，加入800μL的氯仿/异戊醇（24:1），混匀后4℃，12000r/min离心10min；E．取450μL上清，加入4℃预冷的2倍体积无水乙醇，-20℃放置30min；F．4℃，12000r/min离心15min，弃上清，沉淀用50μL无RNA酶去离子水溶解沉淀，-20℃保存备用，此即为所提取的总RNA样品。取5μL提取后的总RNA样品于1%琼脂糖凝胶电泳检测。电泳结果如图1所示。从图1中可以看出，待检火龙果样品和病样的总RNA均含有18S和28SrRNA条带，表明待检火龙果样品和阳性对照病样总RNA提取成功。（2）设计并合成PCR引物对，按照北京全式金生物科技有限公司的EasyScriptOne-StepRT-PCRSuperMix试剂盒，以第（1）步中所提取的总RNA为模板，进行RT-PCR扩增；PCR引物对设计如下（该引物特异扩增CVX外壳蛋白基因序列，扩增片段大小约为600bp）：上游引物CVX-CPF：5’-CAGTCCGCCGGACCCCG-3’，下游引物CVX-CPR：5’-AGACTCTGAACCTTGGAGCCCC-3’。PCR扩增时，20μL扩增体系设计如下：步骤（1）中所提取总RNA，1μg（2μL）；EasyScriptOne-StepEnzymeMix，0.4μL；上游引物CVX-CPF，0.4μL（10μM）；下游引物CVX-CPR，0.4μL（10μM）；2×One-StepReactionMix，10uL；无RNA酶去离子水，加至20μL；反应程序为：先50℃反转录30min；然后94℃变性3min；再94℃、30sec，56℃、1min，72℃、1min，共35个循环；最后72℃、10min；PCR扩增产物4℃保存备检，或者直接进行后续电泳检测。（3）取步骤（2）中5μLPCR反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，若扩增条带的长度大小约为600bp，则待检样品呈阳性，表明样品中含有仙人掌X病毒。检测结果如图2所示。从图中可以看出，阳性对照CK+呈阳性；阴性对照CK-呈阴性；待检样品第1、2、3、5、6、9、10号CVX呈阳性；而待检样品第4、7、8号CVX呈阴性。表明第1、2、3、5、6、9、10号火龙果样品感染CVX病毒；而第4、7、8号火龙果样品不感染CVX病毒。对步骤（3）中PCR反应产物回收后，可直接连于pMD18-T载体，转化大肠杆菌，挑取阳性克隆进行菌液PCR初步鉴定，对鉴定正确的质粒进一步进行测序，所得序列与仙人掌X病毒相应外壳蛋白基因序列进行比对后，即可最终确定所受感染是否为CVX病毒。对受感染的1号样品进行测序，其测序结果如SEQIDNO.3所示，与CVX病毒的外壳蛋白基因序列比对结果如图3所示，从图3中可以看出，1号样品测序所得序列与CVX病毒的外壳蛋白基因序列（GenbankAccessionNosAB930142，AB930133，AB930137）基本相同，因而可确认为受到了CVX病毒感染。总体而言，本发明中通过特定PCR引物的应用，经过一次RT-PCR，通过特定扩增产物的比对即可较为快速的对相应样品是否受到CVX病毒感染进行判定，该方法尤其适用于批量化、规模化的快速鉴定过程。而对于疑似受感染样品或不确定样品，由于RT-PCR扩增所得目的产物在3’端附加有一个A碱基，因而可将扩增产物直接克隆到pMD18-T载体中，并进一步转化和测序验证，并最终判定是否受到CVX病毒感染。因而，该方法具有较好地延伸性，可为CVX病毒的鉴定提供较好的基础保障。SEQUENCELISTING<110>中国热带农业科学院热带生物技术研究所<120>一种检测仙人掌X病毒所用PCR引物及其应用<130>none<160>3<170>PatentInversion3.5<210>1<211>17<212>DNA<213>PCR引物<400>1cagtccgccggaccccg17<210>2<211>22<212>DNA<213>PCR引物<400>2agactctgaaccttggagcccc22<210>3<211>618<212>DNA<213>CactusvirusX<400>3cagtccgccggaccccgctccactcctcagtccggacctttccaaaccttgtcctcctcc60cagcttgcggccctctcactcggggtcactagctctcttctaccttccccagctgagcta120gtcagcatctcacaagccctgaccaccctaggcgcgtctgccactaacctcactccacta180tccctagaaatagttaattactgctttgacaacgggtcttcaccagaaacagtcttcaag240ggtgactcaactgtgctccagatgccgctctccaaagttgcccatgctatcacccaattc300accactctgagacaattctgcagatactttgcaaagattatctggaattatcgagtctca360aagaatctccctccagcggcatgggaagcctgggcttacaaacccgagcaaaagtttgcc420gccttcgacttcttcgacggcgttctcaatgaggcggccctcaaccccacagatggactt480gtgcgtgtacctaacgaggctgaacgactcgccaaccaaacgaatcgcaacgtccatctc540tttgagagcaacgcacaaaagaacagagcccttaccacttcagctctagtcaccaagggg600ctccaaggttcagagtct618