金钱鱼黄体生成素LH基因、金钱鱼LH重组蛋白及应用的制作方法

文档序号:12249087阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种金钱鱼黄体生成素LH基因,其cDNA序列包括如SEQ ID NO:1所示的碱基序列。

2.一种金钱鱼LH重组蛋白,其特征在于,所述重组蛋白包括如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

3.一种如权利要求2所述的金钱鱼LH重组蛋白的制备方法,其特征在于,获取如权利要求1所述的金钱鱼黄体生成素LH基因的cDNA序列全长,通过原核表达获得金钱鱼LH重组蛋白。

4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,所述获取包括如下步骤:

S1、利用Trizol提取法,利用金钱鱼性腺进行RNA提取,再通过反转试剂盒进行cDNA的合成;

S2、根据步骤S1合成得到的cDNA保守区设计引物,利用RT-PCR和RACE技术,克隆获得金钱鱼LH基因序列全长。

5.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,所述原核表达包括如下步骤:

A1、金钱鱼黄体生成素LH基因的cDNA序列与pGEM-TEasy载体连接后,转化至DH5α感受态细胞,扩增培养;离心收集,抽提含有目的基因(LH基因)和pGEM-TEasy载体的质粒;

A2、根据pET-28a+载体选择酶切位点XhoI(158),NdeI(238),分别对步骤A1抽提得到的质粒DNA进行双酶切;回收有效片段;

A3、纯化;将目的基因和质粒的回收产物连接,连接产物导入BL-21表达感受态细胞;离心分离;挑菌,菌落PCR验证后选取有效菌液;

A4、将所述有效菌液以体积比1∶10转接到含卡那霉素的LB液体培养基中,37℃,振荡培养,进行重组蛋白诱导表达,获取重组粗提蛋白。

6.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,原核表达后还包括通过亲和柱纯化,获得纯的金钱鱼LH重组蛋白的步骤。

7.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,所述亲和柱纯化包括如下步骤:

B1、取1ml镍琼脂糖凝胶FF或镍NTA琼脂糖凝胶FF预装柱,用10ml平衡缓冲液平衡,然后10ml重组粗提蛋白样品以0.5ml/min上样,然后2ml/管分管收集;

B2、用15ml平衡缓冲液洗去未吸附的重组粗提蛋白样品,流速1-2ml/min,2ml/管收集;

B3、用5ml洗脱缓冲液洗去未吸附的重组粗提蛋白样品,流速1-2ml/min,2ml/管收集。

8.一种如权利要求2所述的金钱鱼LH重组蛋白或权利要求3所述的制备方法制得的金钱鱼LH重组蛋白在用作促进鱼类性腺发育药剂中的用途。

9.如权利要求8所述的用途,其特征在于,所述促进鱼类性腺发育药剂为体外注射液。

10.一种鱼用重组蛋白体外注射液,其特征在于,所述体外注射液包括获取如权利要求1所述的金钱鱼黄体生成素LH基因的cDNA序列全长,通过原核表达获得的金钱鱼LH重组蛋白。

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