一种快速简便的筛选CRISPR/Cas基因编辑阳性对象的方法与流程

本发明属于生物领域，具体涉及一种快速简便的筛选crispr/cas基因编辑阳性对象的方法。

背景技术：

随着科技的不断发展，基因编辑技术也取得了长足的进步，目前主要的三大技术为zfn，tanlen和cripsr技术。crispr技术因其方法简单，成本低等越来越成为主流技术，并且成功应用到不同种类的物种中，包括但不限于动物，植物和微生物中。

crispr/cas系统(crispr相关系统)，crispr(clusteredregulatoryinterspacedshortpalindromicrepeat)即成簇的、规律间隔的短回文重复序列，是基因组中一个含有多个短重复序列的位点，这种位点在细菌和古细菌(archaea)胞内起到了一种获得性免疫(acquiredimmunity)的作用。crispr系统主要依赖crrna和tracrrna来对外源dna进行序列特异性降解。目前已经发现了3种crispr/cas系统，其中在2型系统(typeiisystems)中依赖的是cas9蛋白。在rna的介导下，cas9蛋白能够对crrna–tracrrna识别的靶序列尾部第三和第四个碱基之间进行切割，使dna靶序列断裂，形成dsb，进而诱发dsb修复机制。该修复机制带有一定的随机性，可导致修复后的断裂处的dna序列与原始序列不同，可产生碱基插入、碱基替换、碱基缺失等情况。

在进行crispr/cas基因编辑之前需要设计敲除位点及其对应的用于构建敲除载体的oligo序列，每个位点对应1对oligo序列；同时设计一对用于后期筛选以及测序使用的引物，用这对引物可扩增的区域包含敲除位点区域。筛选crispr/cas基因编辑阳性对象，即通过技术手段，检测目标群体中，是否包含dna断裂处的序列与原始序列不同的个体。一般情况下，先通过不同方法获取基因编辑处理后的单克隆样本，进而获取单克隆样本的基因组。之后，针对不同的前期实验设计，有不同的筛选方法。目前，筛选crispr/cas9基因编辑阳性对象的方法可以分为几个大类。本方法可替代的方法有两个大类：第一类需要设计额外的pcr引物，且该方法不适用于所有前期实验设计；第二类需要使用一种dna内切酶，该方法易出现假阳性，且增加了操作步骤。

前期实验设计为同时切割同一条dna上相邻较远的两个位置，方法a：直接使用筛选引物进行pcr扩增，通过琼脂糖凝胶电泳检测，选取扩增条带明显较理论长度短的样本进行进一步测序验证；方法b：额外设计一条位于筛选引物对之间的pcr引物，与筛选引物中的一条一起进行pcr扩增，通过琼脂糖凝胶电泳检测，选取无扩增条带的样本进行进一步测序验证，有时为防止假阳性，还需设计确保实验过程无差错的验证引物。

前期实验设计为同时切割同一条dna上相邻较近的两个位置，方法c：同方法b，但可直接使用筛选引物对作为验证引物；方法d：直接通过筛选引物进行pcr扩增，所有样本直接通过测序验证，有时可通过琼脂糖凝胶电泳检测，选取扩增条带长度与理论值有微弱变化的样本进行进一步测序验证；方法e：直接通过筛选引物进行pcr扩增，将扩增产物按比例与原始dna序列的扩增产物按比例混合，通过一轮变性-退火，使用错配酶(主要是cel1或t7e1酶)处理后，通过琼脂糖凝胶电泳检测，选取dna电泳条带在理论大小条带的下方出现1条或两条较小条带的样本进行进一步测序验证。前期实验设计仅切割dna上的一个位置，筛选方法使用方法d或方法e。

以上方法存在的问题：方法a：适用范围窄，只有当两个切割位点距离足够大时，通过琼脂糖凝胶电泳结果才可判断；会遗漏合格的样本，比如，在1个或2个切割位点dna序列都发生改变的样本。方法b、c：需要额外设计引物；会遗漏合格的样本，比如，在1个或2个切割位点dna序列都发生改变的样本。方法d：会产生大量的测序费用；由于测序需要一定的时间，在不能排除非目标个体的情况下，需要维持所有个体的存活，增加了劳动量和材料成本。方法e：增加了多个操作步骤，使筛选时间变长；错配酶价格较高，增加了成本，且会产生假阳性与假阴性。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种快速简便的筛选crispr/cas基因编辑阳性对象的方法，使用构建敲除载体的oligodna片段作为筛选目标样本的一条pcr引物，不要设计额外的pcr引物，适用于几乎所有实验设计，实验步骤少，不需要购买特别的dna内切酶，用于测序的样本具有较高的合格率，且不遗漏合格的样本。

本发明提供的一种快速简便的筛选crispr/cas基因编辑阳性对象的方法，包括以下步骤：

1)设计测序引物对，选取筛选组引物对；

2)设计引物对的退火温度；

3)基因组提取；

4)使用步骤1)设计的引物对分别进行pcr扩增；

5)扩增后进行琼脂糖凝胶电泳，在对照组的pcr都有电泳条带的情况下，如果筛选组未出现预测的电泳条带，则对应的样本即是初步筛选的目标；

6)选取步骤5)筛选到的样本，使用测序引物对该样本的基因组进行pcr扩增，ta克隆后进行dna测序，分析测序结果，验证该样本是否符合实验设计。

步骤1)中所述测序引物作为对照组的引物对，根据常规方法设计。

进一步的，步骤1)中所述筛选组引物对的选取包含2种情况，但作为引物使用的oligodna片段都是正向的那一条，即包含识别位点序列的oligodna片段。情况1、前期实验设计为同时编辑同一条dna上的两个位点，且这两个位点距离适中，同时这2处的含识别位点序列是相对的，即以这两处的正向oligodna片段作为引物能够正常进行pcr扩增。其余情况为情况2。

情况1：筛选时，用1对筛选引物同时检测2个位点的变化，筛选引物对为两个正向oligodna片段。

情况2：筛选时，用1对筛选引物只检测1个位点的变化，筛选引物对为该位点的正向oligodna片段，和其中一条能够与其组合进行pcr的测序引物。

进一步的，步骤2)具体为：通过退火温度计算软件，确定引物对的理论最佳退火温度。在此基础上，以此温度为中心，设置4-5个梯度，每个梯度间温度差为1.5-2.0℃。根据pcr反应后的琼脂糖凝胶电泳结果，确定实际退火温度的可用范围。

进一步的，步骤2)优选为，对照组选择实际退火温度的为范围内的温度；筛选组选择实际退火温度的可用范围内的最高温度。

步骤3)具体包括以下步骤：

3-1)材料初步处理：

组织：切成1mm³大小，取1-2块放入96孔pcr板中，并做好标记；

细胞：在细胞正常传代状态下，吸取100-150ul细胞悬液到96孔pcr板中，并做好标记，用微孔板离心机，室温，1000-1500rpm，离心10min，离心结束后，吸除部分上清，保留10ul液体和细胞沉淀；

3-2)加入提取试剂：

组织样本：每孔加入15-20ul微量样品核酸快速提取试剂；

细胞样本：每孔加入10-15ul微量样品核酸快速提取试剂；

将96孔pcr板用微孔板离心机进行瞬时离心，将试剂和材料都聚集在每孔的底部；

3-3)获取基因组：

在pcr仪中，进行65℃孵育10min，98℃孵育5min，之后置于冰上备用。

步骤3-2)中使用的微量样品核酸快速提取试剂购自南京精易智生物科技有限公司。

步骤4)为：

将筛选组引物对配制引物预混体系a，对照组的测序引物对配制引物预混体系b，2种预混体系由pcr用水、上游引物(10umol/l)、上游引物(10umol/l)按8:1:1配制，准备2块96孔pcr板a、b，置于冰上，先向pcr板a、b每孔加入2×taqmastermix，再向pcr板a每孔加入引物预混体系a，向pcr板b每孔加入引物预混体系b，最后分别向pcr板a、b每孔加入不同编号的基因组。混匀后，将所有液体瞬时离心到管底部，退火温度按照步骤2)的结果设定，扩增35-40个循环，其余条件根据试剂说明书设定，进行pcr反应。

步骤4)具体为：

将筛选组引物对配制引物预混体系a，对照组的测序引物对配制引物预混体系b，2种预混体系由pcr用水、上游引物(10umol/l)、上游引物(10umol/l)按8:1:1配制，准备2块96孔pcr板a、b，置于冰上，先向pcr板a、b每孔加入10ul的2×taqmastermix，再向pcr板a每孔加入8ul的引物预混体系a，向pcr板b每孔加入8ul的引物预混体系b，最后分别向pcr板a、b每孔加入2ul不同编号的基因组，混匀后，将所有液体瞬时离心到管底部，退火温度按照步骤2)的结果设定，扩增35-40个循环，其余条件根据试剂说明书设定，进行pcr反应。

2×taqmastermix购买自南京诺唯赞生物科技有限公司。

进一步的，步骤4)中，以2倍体个体为例：其pcr反应若是使用了1条正向oligodna，则代表等位基因的2条dna序列都发生改变；不会出现只是其中1条dna序列发生改变的情况，避免了大量杂合样本的干扰。若是使用了2条正向oligodna，则代表等位基因的2条dna中，每1条的序列至少存在1处发生改变。本方法一步可以检测出所有满足要求的样本，同时避免了繁琐的结果分析。

本发明使用构建敲除载体的oligodna片段作为筛选目标样本的一条pcr引物，利用引物3’端的序列在pcr反应中需要与模板完全匹配，才能高效引发pcr反应的特点，对dna上可能的突变进行检测。采用本发明的方法减少了实验步骤，且不要设计额外的pcr引物，适用于几乎所有实验设计，不需要购买特别的dna内切酶，几乎不会出现假阳性。同时获得的用于测序的样本具有较高的合格率，且几乎不遗漏合格的样本。

附图说明

图1为实验设计为只编辑一个位点的情况，正向oligodna为情况a时，筛选组引物对为：正向oligodna、下游测序引物；正向oligodna为情况b时，筛选组引物对为：上游测序引物、正向oligodna；

图2为实验设计为同时编辑两个位点的情况，会有两个正向oligodna(a和b)，每个筛选引物对的选择参考只编辑一个位点的情况时的方法，如果前期实验设计的2个位点相距适中，且分别位于同一条dna双链的不同单链的5’端，此时筛选引物对可以由两个变成一个，选择为：a正向oligodna、b正向oligodna；

图3实施例1hnrnpa2b1基因的敲除位点ko1和上下游测序引物在dna序列上的位置，根据三者的位置关系，选取ko1的正向oligodna与下游测序引物作为筛选引物对；

图4实施例1基因编辑成功后，等位基因的2条dna序列的变化情况，敲除情况1在原始序列中空白处多出的序列(仅列出部分)为插入的序列，敲除情况1和2中的“*”代表缺失的序列；

图5实施例2period1基因的敲除位点ko1、ko2和上下游测序引物在dna序列上的位置，根据这4者的位置关系，选取ko1的正向oligodna与ko2的正向oligodna作为筛选引物对；

图6实施例2具体的敲除的情况，敲除位置都发生在敲除位点ko2处，图中敲除情况黑色部分表示序列与原始序列一致，白色位置表示该处相对于原始序列为缺失。

具体实施方式

实施例1

一种快速简便的筛选crispr/cas基因编辑阳性对象的方法，包括以下步骤：

具体是cho-k1细胞中mhnrnpa2b1基因单位点敲除筛选

在ncbi上，查询hnrnpa2b1(ncbigeneid:nm_016806.3)的基因组信息。设计一个敲除位点ko1及其对应的oligodna序列ko1-f、ko1-r，同时设计好上下游的测序引物f和r(图3)。

ko1-f：caccgagcgactgagtccgcgatgg

ko1-r：aaacccatcgcggactcagtcgctc

f：gtggggttaatagctcagct

r：agaaggaacaggctaaggtg

1)敲除位点ko1对应的oligodna杂交后，连接到pspcas9-2a-puro敲除载体bbsi位点中，构建成质粒pko1。

2)转化top10competentcell，筛选阳性重组子并测序验证。

3)质粒大提，去内毒素用于转染；

4)细胞转染；

a)取状态良好的对数生长期cho-k1细胞悬液台盼蓝计数，确定细胞数及细胞活力(细胞活力>95％)；

b)取5×10⁶细胞铺六孔板。

c)隔天，用2ug的质粒转染靶细胞，转染试剂为lipo2000，比值为1:2.5。

5)细胞有限稀释，单克隆生长，基因组提取。

a)转染48hr后，pool细胞台盼蓝计数。

b)采用有限稀释法对pool细胞分单克隆至96孔板中；

c)2-3周后，将96孔板中单个克隆的细胞消化，用200ul培养基终止消化，每个样本吸取100ul采用微量样品核酸快速提取试剂盒进行基因组获取，其余继续培养。

将用于获取基因组的细胞悬液，转移到96孔pcr板中，并做好标记，用微孔板离心机，室温，1500rpm，离心10min，离心结束后，吸除90ul上清；每孔加入10ul微量样品核酸快速提取试剂，小心混匀；将96孔pcr板用微孔板离心机进行瞬时离心，将试剂和材料都聚集在每孔的底部；在pcr仪中，进行65℃孵育10min，98℃孵育5min，之后置于冰上备用。

6)单克隆筛选，对照组用f、r作为引物，实验组用ko1-f、r作为引物，以获取的基因组为模板，进行pcr扩增和琼脂糖凝胶电泳。在对照组获得约460bp的目标条带的情况下，实验组无约180bp的目的条带时，则为潜在的阳性克隆。

步骤6)中pcr扩增参照下表设置pcr程序(表1)，其中最佳退火温度59℃来自第一步摸索筛选pcr的条件获取的最佳条件。

表1pcr反应程序

7)将潜在的阳性克隆的对照组的pcr产物进行ta克隆，经dna测序，得到具体的敲除的情况。通过比对，发现潜在阳性克隆的等位基因的2条dna序列都发生了突变且变化不同，其中一条缺失一段的同时又插入了一段其它dna序列；另一条dna序列缺失了一个碱基(图4)。

实施例2

一种快速简便的筛选crispr/cas基因编辑阳性对象的方法，包括以下步骤：

具体为：mef细胞中period1基因双位点敲除筛选

在ncbi上，查询period1(ncbigeneid:18626)的基因组信息。设计两个敲除位点ko1和ko2及其对应的oligodna序列ko1-f、ko1-r、ko2-f、ko2-r，同时设计好上下游的测序引物cxf和cxr(图5)。

ko1-f：caccgattagtcagccctcagagac

ko1-r：aaacgtctctgagggctgactaatc

ko2-f：caccgcccccatcggccccttctag

ko2-r：aaacctagaaggggccgatgggggc

cxf：gtggggttaatagctcagct

cxr：agaaggaacaggctaaggtg

1)两个敲除位点ko1和ko2对应的oligodna分别杂交后，并分别连接到pspcas9-2a-puro敲除载体bbsi位点中，构建成质粒pko-1、质粒pko-2。

2)转化top10competentcell，筛选阳性重组子并测序验证。

3)质粒大提，去内毒素用于转染。

4)细胞转染

a)取状态良好的对数生长期mef细胞悬液台盼蓝计数，确定细胞数及细胞活力(细胞活力>95％)

b)取5×10⁶细胞铺六孔板。

c)隔天，进行细胞转染，2ug的质粒pko-1和2ug的质粒pko-2共转染靶细胞，转染试剂为lipo2000，比值为1:2.5。

5)细胞有限稀释，单克隆生长，基因组提取。

a)转染48hr后，pool细胞台盼蓝计数。

b)采用有限稀释法对pool细胞分单克隆至96孔板中；

c)2-3周后，将96孔板中单个克隆的细胞消化，用200ul培养基终止消化，每个样本吸取100ul采用微量样品核酸快速提取试剂盒进行基因组获取，其余继续培养。

将用于获取基因组的细胞悬液，转移到96孔pcr板中，并做好标记，用微孔板离心机，室温，1500rpm，离心10min，离心结束后，吸除90ul上清；每孔加入10ul微量样品核酸快速提取试剂，小心混匀；将96孔pcr板用微孔板离心机进行瞬时离心，将试剂和材料都聚集在每孔的底部；在pcr仪中，进行65℃孵育10min，98℃孵育5min，之后置于冰上备用。

6)单克隆筛选，对南京精易智生物科技有限公司照组用cxf、cxr作为引物，实验组用ko1-f和ko2-f作为引物，以提取的基因组为模板，进行pcr扩增和琼脂糖凝胶电泳。在对照组获得约545bp的目标条带的情况下，筛选组无约150bp的目的条带时，则为潜在的阳性克隆。

步骤6)中pcr扩增参照下表设置pcr程序(表2)，其中最佳退火温度58℃来自第一步摸索筛选pcr的条件获取的最佳条件。

表2pcr反应程序

7)将潜在的阳性克隆的对照组的pcr产物进行ta克隆，后测序检测，得到具体的敲除的情况(图6)。通过比对，发现潜在阳性克隆的等位基因的2条dna序列都发生了突变，其中一条缺失一小段(28bp)；另外一条缺失了一个大片段(203bp)。