6所示。
[0015] 序列表中SEQIDNo. 5由20个碱基组成，该序列为AhFAD2B基因0RF区自5'端 413-432位碱基序列；SEQIDNo. 6由20个碱基组成，该序列为AhFAD2B基因0RF区自5' 端528-547位碱基的反向互补序列；扩增长度为135bp。
[0016] 一种用于检测AhFAD2B基因442位A碱基插入的TaqMan探针3,该TaqMan探针3 由一段21个碱基组成的核苷酸序列和位于核苷酸序列5'端的HEX发光基团及位于核苷酸 序列3'端的BHQ1荧光淬灭基团组成，核苷酸序列如SEQ IDNo.7序列。
[0017] 序列表中SEQIDNo.7由21个碱基组成，该序列为AhFAD2B基因0RF区自5'端 433-453位碱基序列。
[0018] 一种用于检测AhFAD2B基因442位A碱基缺失的TaqMan探针4,该TaqMan探针4 由一段20个碱基组成的核苷酸序列和位于核苷酸序列5'端的FAM发光基团及位于核苷酸 序列3'端的BHQ1荧光淬灭基团组成，核苷酸序列如SEQIDNo. 8序列。
[0019] 序列表中SEQIDNo. 8由20个碱基组成，该序列为AhFAD2B基因0RF区自5'端 438-457位碱基序列。
[0020] 一种标记辅助筛选AhFAD2A基因等位变异的方法，包括如下步骤：
[0021] (1)提取供试花生材料的叶片或种子的基因组DNA;
[0022] (2)以步骤⑴基因组DNA为模板，配制PCR反应体系，PCR引物的核苷酸序列如 SEQIDNo. 1和SEQIDNo. 2所示，荧光探针为TaqMan探针1和TaqMan探针2,检测反应 体系的荧光强度，然后进行PCR扩增，扩增后再次检测荧光强度；
[0023] (3)对步骤⑵的检测结果进行分析，当检测到仅有TaqMan探针1的荧光时，则 第448位为A碱基纯合，记为aa;当检测到仅有TaqMan探针2的荧光时，则第448位G碱 基为纯合，记为AA;当检测到有TaqMan探针1和TaqMan探针2的荧光时，则第448位为杂 合子，记为Aa。
[0024] 根据本发明优选的，所述步骤（2)中的PCR反应体系为20yL，组分如下：
[0025]
[0026]
【主权项】
1. 一种用于检测AhFAD2A基因448位G/A差异的引物，该引物为一对，核巧酸序列如 SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 所示。
2. -种用于检测AhFAD2A基因448位A碱基的化qMan探针1，该化qMan探针1由一 段22个碱基组成的核巧酸序列和位于核巧酸序列5'端的TAMRA发光基团及位于核巧酸序 列3'端的B册2英光浑灭基团组成，核巧酸序列如SEQ ID No. 3所示。
3. -种用于检测AhFAD2A基因448位G碱基的化qMan探针2,该化qMan探针2由一 段23个碱基组成的核巧酸序列和位于核巧酸序列5'端的CY5发光基团及位于核巧酸序列 3'端的B册2英光浑灭基团组成，核巧酸序列如SEQ ID No. 4序列。
4. 一种用于检测AhFAD2B基因442位A碱基插入或缺失的引物，该引物为一对，核巧酸 序列如 SEQ ID No. 5 和 SEQ ID No. 6 所示。
5. -种用于检测AhFAD2B基因442位A碱基插入的化qMan探针3,该化qMan探针3 由一段21个碱基组成的核巧酸序列和位于核巧酸序列5'端的肥X发光基团及位于核巧酸 序列3'端的B册1英光浑灭基团组成，核巧酸序列如SEQ ID No. 7序列。
6. -种用于检测AhFAD2B基因442位A碱基缺失的化qMan探针4,该化qMan探针4 由一段20个碱基组成的核巧酸序列和位于核巧酸序列5'端的FAM发光基团及位于核巧酸 序列3'端的B册1英光浑灭基团组成，核巧酸序列如SEQ ID No. 8序列。
7. -种标记辅助筛选AhFAD2A基因等位变异的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1)提取供试花生材料的叶片或种子的基因组DNA; 似W步骤（1)基因组DNA为模板，配制PCR反应体系，PCR引物的核巧酸序列如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示，英光探针为化qMan探针1和化qMan探针2,检测反应体系 的英光强度，然后进行PCR扩增，扩增后再次检测英光强度； 做对步骤似的检测结果进行分析，当检测到仅有化qMan探针1的英光时，则第448 位为A碱基纯合，记为aa ;当检测到仅有化qMan探针2的英光时，则第448位G碱基为纯 合，记为AA ;当检测到有化qMan探针1和化qMan探针2的英光时，则第448位为杂合子， 记为Aa。
8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤（2)中的PCR反应体系为20 y L， 组分如下：
根据本发明优选的，所述步骤（2)中PCR扩增反应条件如下： 95C预变性Imin ;扩增反应，95C变性15s，6(TC延伸lmin，40个循环；
根据本发明优选的，所述步骤（2)中检测反应体系的焚光强度为在6(TC条件下检测 Imin ； 根据本发明优选的，所述步骤（2)中再次检测反应体系的英光强度为在6(TC条件下检 测 Imin。
9. 一种标记辅助筛选AhFAD2B基因等位变异的方法，其特征在于，包括如下步骤： (i)提取供试花生材料的叶片或种子的基因组DNA; 扣）W步骤（i)基因组DNA为模板，配制PCR反应体系，PCR引物的核巧酸序列如SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示，英光探针为化qMan探针7和化qMan探针8,检测反应体系 的英光强度，然后进行PCR扩增，扩增后再次检测英光强度； (iii)对步骤（ii)的检测结果进行分析，当检测到仅有化qMan探针7的英光时，则第 442位为A碱基插入纯合，即突变基因型，记为化；当检测到仅有化qMan探针8的英光时， 则第442位A碱基缺失纯合，即野生基因型，记为BB ;当检测到有化qMan探针7和化qMan 探针8的英光时，则第442位为杂合子，记为化。
10. 如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤（ii)中的PCR反应体系为20 y L， 组分如下：
根据本发明优选的，所述步骤（ii)中PCR扩增反应条件如下： 95C预变性Imin ;扩增反应，95C变性15s，6(TC延伸lmin，40个循环； 根据本发明优选的，所述步骤（ii)中检测反应体系的英光强度为在6(TC条件下检测 Imin ； 根据本发明优选的，所述步骤（ii)中再次检测反应体系的英光强度为在6(TC条件下 检测Imin。
【专利摘要】本发明涉及一种检测花生FAD2基因SNP等位变异的引物、探针及方法。用于检测AhFAD2A基因448位A/G碱基的TaqMan探针和用于检测AhFAD2B基因442位A碱基插入/缺失的TaqMan探针，该TaqMan探针由一段碱基组成的核苷酸序列和位于核苷酸序列5′端的发光基团及位于3′端的荧光淬灭基团组成。本发明针对与花生油酸亚油酸含量密切相关的AhFAD2A ORF区448位A/G等位变异和AhFAD2B ORF区442位A碱基的缺失与插入，分别设计了特异引物和探针，可鉴别AhFAD2A和AhFAD2B基因，解决了现有技术只能鉴别AhFAD2B基因而无法鉴别AhFAD2A基因的问题。
【IPC分类】C12N15-11, C12Q1-68
【公开号】CN104593510
【申请号】CN201510051695
【发明人】单雷, 徐平丽, 唐桂英, 刘玮, 柳展基
【申请人】山东省农业科学院生物技术研究中心
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年1月30日