Gln-Gly (SEQ ID NO :3)、Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Ser(SEQ ID NO :5)，以及在这一领域内已知的任何其他蛋白水解位点。
[0015] 组氨酸标签优选由三个至八个组氨酸残基组成。
[0016] 在本发明的一个实施方案中，融合蛋白包括以上限定的融合载体蛋白，连接至少 一个目标肽。所述目标肽可以连接到所述融合载体蛋白的C-末端或者N-末端。一般情况 下，所述目标肽有10-200个氨基酸的序列长度。
[0017] 在本发明的一个实施方案中，融合蛋白的DNA序列是经密码子优化的，用于在其 细胞宿主中有效翻译。
[0018] 在本发明的一个实施方案中，所述目标肽优选选自以下的肽：可的瑞林、甲状旁腺 素、胰高血糖素样肽及其衍生物艾塞那肽和利拉鲁肽、恩夫韦肽、降血钙素、比伐卢定、齐考 诺肽、舍莫瑞林、生长瑞林、分泌素、替度鲁肽和胰岛素原、水蛭素、生长激素、生长因子、生 长激素释放因子、促肾上腺皮质激素、释放因子、德舍瑞林、去氨加压素、依降钙素、胰高血 糖素、亮丙瑞林、促黄体（生成）激素释放激素、分泌素、生长激素抑制素、促甲状腺激素释 放激素、曲普瑞林、血管活性肠肽、干扰素、甲状旁腺激素、BH3肽、β -淀粉样变肽或上述肽 的片段。
[0019] 所述融合蛋白优选还包含在所述融合载体蛋白与所述目标肽之间的裂解位点。
[0020] 依据本发明，还提供了一种编码上述的融合蛋白的核酸序列。该核酸序列是经密 码子优化的，用于在其细胞宿主中有效翻译。
[0021] 仍依据本发明，提供了一种包括上述核酸序列的表达载体，所述序列连接至用于 表达编码所述融合蛋白的所述核酸序列的启动子。所述启动子可以是例如PL启动子、 Iamda启动子、pBAD启动子、trc启动子或者Τ7启动子。
[0022] 依据本发明，提供了一种宿主细胞，例如大肠杆菌（E. C〇li)T〇plO、DH5a、DHlOb、 BL21或者JMlOl细胞，所述宿主细胞转化有上述表达载体。优选地，所述宿主细胞为大肠杆 菌或者枯草芽孢杆菌（B. subtilis)。或者，所述宿主细胞为酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物 细胞。
[0023] 依据本发明，提供了一种产生融合蛋白的方法，包括在适合表达所述表达载体的 条件下培养上述宿主细胞，从而产生融合蛋白。所述合适条件可以包括用于诱导所述宿主 细胞表达所述表达载体的诱导剂。该诱导剂可以是阿拉伯糖、IPTG或者温度。在本发明的 一个实施方案中，所述方法还包括对所产生的融合蛋白进行纯化的步骤。
[0024] 所述纯化步骤优选包括乙醇沉淀、离子交换、使用Ni-NTA琼脂糖树脂的亲和纯化 中的至少一个。在该方法中，所述融合蛋白优选还被蛋白水解消化，以从所述融合蛋白中释 放所述目标肽。所述蛋白水解消化可以例如通过溴化氰、甲酸、HC1、凝血酶或者蛋白酶（例 如胰蛋白酶）实现。所释放的目标肽可以被HPLC更进一步纯化。
[0025] 依据本发明，提供了上述融合载体蛋白或核酸用于表达目标肽的用途。所述核酸 可以被用于表达载体中，用于表达目标蛋白。上述的宿主细胞也可以用于表达目标蛋白。
[0026] 本发明中的相关术语定义如下。
[0027] 本文使用的术语"sfGFP"或"超折叠绿色荧光蛋白"是指这样的多肽，即其来源 于或者基于超折叠绿色焚光蛋白的蛋白序列和它的变体（Pedelacq J.D.et al. ,Nature Biotechnology，1 ;79_88, 2006 ;and Tansila N. et al. , Biotechnology Letters,30 ； 1391-1396, 2008)，以及其他重排的、截短的变体或其中一些氨基酸已被删除、替换的杂交 形式，以及修饰例如其中一个或者多个氨基酸已被变成修饰的如糖基化的氨基酸或非常用 氨基酸，条件是所述杂合形式或修饰形式的蛋白保持sfGFP作为载体蛋白的生物学活性。 优选的变体中有保守的氨基酸替换，发生在一个或多个预测的非必需氨基酸残基处。"保 守氨基酸替换"是指氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换。具有相似侧链的氨基 酸残基的家族在本领域中已有定义。这些家族包括具有碱性侧链（如赖氨酸、精氨酸、组 氨酸）、酸性侧链（如天冬氨酸、谷氨酸）、非带电极性侧链（甘氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、丝 氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸）、非极性侧链（如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨 酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸）、β-支链的侧链（如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸）和芳香 族侧链（如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸）的氨基酸。这样，GFP中的预测的非必需氨 基酸残基就被来自相同侧链家族的另外的氨基酸残基所替换。或者，在另外一个实施方案 中，突变可以例如通过饱和诱变在部分或全部sfGFP编码序列中被随机引入，所得的变体 可以被筛选出来以鉴定保持活性的变体。
[0028] 不包含第一个甲硫氨酸的整个超折叠绿色荧光蛋白的氨基酸序列以及编码该蛋 白的DNA的经密码子优化后的核酸序列分别如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示。
[0029] 所述目标肽是指作为产物的任何小蛋白或寡肽。为了本发明的实际应用，肽应当 包括由肽键连接的最少10个氨基酸残基，或由肽键连接的最多200个氨基酸残基。
[0030] 本文使用的"裂解位点"是指这样的氨基酸序列，其包括氨基酸或氨基酸的序列， 该氨基酸或氨基酸的序列为化学试剂或者酶提供了识别位点，以使该肽链在该位点被所述 化学试剂或酶裂解。
[0031] "转化的宿主细胞"是指包含重组体材料的细菌、酵母、昆虫或哺乳动物细胞，或包 含表达重组产物所需的遗传物质的细菌、酵母、昆虫或哺乳动物细胞。遗传物质可以被任何 已知的方法引入细胞，这些方法包括转化、转导、电穿孔和转染。通常情况下，在整个本发明 中，术语"转化的"或"转化"不是特指以上提及的已知方法的任一种。
[0032] 除非另有定义，本文使用的所有技术或科学术语与本发明所属的专业领域中的普 通技术人员所理解的相同。虽然类似或等同于本文描述的方法和材料可以用于实施或测试 本发明，合适的方法和材料如下所述。所有出版物、专利申请、专利和本文提及的其它参考 文献都以其整体通过引用并入。在冲突的情况下，以本说明书，包括定义为准。此外，材料、 方法和实施例仅是说明性的，而不是为了进行限制。
[0033] 从以下的详细描述和权利要求书可以很明显地发现本发明的优点和其它特点。
【附图说明】
[0034] 图IA和图IB显示了本发明的融合蛋白的可能排列，其中目标肽连接到所述C-末 端（图1A)或所述N-末端（图1B)或所述载体蛋白。
[0035] 图2A和图2B显示了图IA和图IB的融合蛋白的多个实施方案。其中裂解位点（C 位点）连接所述载体蛋白和所述目标肽。
[0036] 图3A和图3B显示了本发明的融合蛋白的其它两个实施方案，目标肽有一个（图 3A)或多个（图3B)重复。
[0037] 图4A和图4B分别显示了两个质粒pSFGFPN-NcoI和pSFGFPC-MCS表达载体，含有 用作载体蛋白的超折叠绿色荧光蛋白。
[0038] 图5显示了在以阿拉伯糖诱导4小时和21小时后，包涵体中的所表达的 prolispro-sfGFP 融合蛋白的 SDS-PAGE。
[0039] 图6显示了所表达的sfGFP-proinsulin赖脯胰岛素融合蛋白在用胰蛋白酶和羧 基肽酶B消化后的SDS-PAGE。
[0040] 图7显示了纯化的赖脯胰岛素的M0LDI-T0F质谱分析。
[0041] 图8显示了所表达的sfGFP-PTH融合蛋白的SDS-PAGE。
[0042] 图9显示了所表达的sfGFP-Calcitonin融合蛋白SDS-PAGE。
[0043] 图10显示了所表达的sfGFP-GLPl融合蛋白SDS-PAGE。
【具体实施方式】
[0044] 通过融合蛋白以可溶或包涵体的形式表达重组肽是公认的方法。本发明利用一种 新的载体蛋白，以提供用于产生重组肽的另一种方法。所述载体蛋白源于超折叠绿色荧光 蛋白。通过融合蛋白编码并从中释放的重组肽可以根据本文描述的这些方法回收。本发明 提供了融合蛋白构建体，以建立一种新的、低成本的且高效率的方法，用于大规模制备重组 肽。
[0045] 依据本发明，因此提供了一种通过使用新的融合蛋白产生重组肽的方法。所述载 体蛋白是超折叠绿色荧光蛋白或其变体之一。由超折叠绿色荧光蛋白引导的融合蛋白在大 肠杆菌中高表达。所述超折叠的绿色荧光蛋白和所述目标肽可以通过蛋白水解敏感（裂 解）位点连接。所述裂解位点通常是特定的氨基酸或氨基酸的特定序列以生成融合蛋白， 所述融合蛋白被裂解剂选择性地裂解。裂解剂可以是化学试剂如溴化氰或酸。裂解剂也可 以是内肽酶，如胰蛋白酶，、凝血酶，、肠激酶，或另一种其他特异性蛋白酶。
[0046] 本发明的一个实施方案提供了一种改进的方法，用于在细菌细胞内表达不溶性的 包涵体