形式的融合蛋白后，获得来自所述细胞的重组肽。该融合蛋白以包涵体形式表达，增 加了所述重组肽的产率，并保护了所述目标肽的完整性。
[0047] 本发明的第二实施方案涉及一种改进的方法，以通过在超折叠绿色荧光蛋白中插 入一个或多个组氨酸标签来简化纯化步骤。由化学试剂或内肽酶裂解所述融合蛋白后，所 述超折叠绿色荧光蛋白标签可以通过重复组氨酸标签亲和纯化得以除去。籍此，一般可以 减少来自其它细胞蛋白裂解过程的污染物。
[0048] 第三实施方案涉及一种表达所述融合蛋白的方法，其中甲硫氨酸残基连接所述目 标肽和所述载体超折叠绿色荧光蛋白。所述融合蛋白以包涵体形式表达，并在变性条件例 如用尿素或盐酸胍下纯化。所述融合蛋白可以溶解于甲酸，然后用溴化氰裂解，以释放所述 目标肽。在裂解所述融合蛋白后，包含超折叠绿色荧光蛋白的片段可以通过色谱法除去。
[0049] 第四实施方案涉及一种表达含有甲硫氨酸残基的目标肽的方法。所述融合蛋白以 包涵体形式表达，并在变性条件下例如用尿素或盐酸胍纯化。所述融合蛋白可以通过相对 生理缓冲液透析而重折叠。然后，可以用蛋白水解酶如胰蛋白酶、TEV蛋白酶或凝血酶裂解 所述融合蛋白以释放所述目标肽。在裂解所述融合蛋白后，可以通过色谱去除含有超折叠 绿色荧光蛋白的片段。
[0050] 本发明的第五实施方案涉及所述目标肽与载体蛋白超折叠绿色荧光蛋白的氮末 端或碳末端的融合物，如图IA和图IB所示。所述目标肽的大小可以是10到200个氨基酸 残基。所述载体蛋白具有SEQ ID NO :1中列出的氣基酸序列。
[0051] 所述融合蛋白的大小会随着所述目标肽的性质和拷贝数量而有变化。所述融合蛋 白应该足够大，以避免被内源性蛋白酶降解。所述融合蛋白可以如图IA和图IB中所示的 两种方式进行排列。或者，所述目标肽与载体蛋白（超折叠绿色荧光蛋白）的N-末端或 C-末端通过具体氨基酸序列的裂解位点（图2A和图2B)连接。在图2A和图2B中，裂解位 点包含的氨基酸或氨基酸的序列，提供了化学反应或酶反应的识别位点，使得所述的化学 试剂或酶裂解该位点的肽链。
[0052] 所述目标肽可以由10到200氨基酸残基的一个或多个连续序列组成。大的肽特 别是来源于没有独特三维结构的蛋白序列的那些。多种目标肽可以有如图3A和图3B所示 的几种形式。在图3A中，一个包括单个拷贝的所述目标肽。在图3B中，另一个由多个串联 重复的单个目标肽组成。每个重复序列可以是相同的或不同的肽，所述重复由"互连"序列 连接，所述"互连"序列可以是 Met、Lys、Arg、Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly (SEQ ID NO : 3)、Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln_Ser(SEQ ID N0:5)或其他合适的氨基酸序列。所述互连序 列不是必须与连接所述载体蛋白和所述目标肽的"连接"序列不同。使用不同的连接连接 体提供了这样的优点，即两个或多个不同的裂解剂（如化学物质或酶）可以从所述融合蛋 白中逐个地释放所述目标肽并将所述每个目标肽彼此分离。
[0053] 所述融合的肽的具体实施方案是目标肽可以以单个的或多个连接的重复出现，其 包括可的瑞林、甲状旁腺素、胰高血糖素样肽及其衍生物艾塞那肽和利拉鲁肽、恩夫韦肽、 降血钙素、比伐卢定、齐考诺肽、舍莫瑞林、生长瑞林、分泌素、替度鲁肽和胰岛素原、水蛭 素、生长激素、生长因子、生长激素释放因子、促肾上腺皮质激素、释放因子、德舍瑞林、去氨 加压素、依降钙素、胰高血糖素、亮丙瑞林、促黄体（生成）激素释放激素、分泌素、生长激素 抑制素、促甲状腺激素释放激素、曲普瑞林、血管活性肠肽、干扰素、甲状旁腺激素、BH3肽、 β -淀粉样变肽。这些肽的一个共同特性是它们都具有柔性和脆弱的构象，使它们不稳定， 容易蛋白水解式降解。
[0054] 所述裂解位点和所述目标肽优选经过选择，以使所述目标肽不包含相同裂解位 点。所述裂解位点包括 Met、Lys、Arg、Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly (SEQ ID NO :3)、 Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln_Ser(SEQ ID N0:5)或其他合适的氨基酸序列。可以设计新的 裂解位点，以使用化学裂解剂或酶或这两者的组合。在某些情况下，可能需要利用裂解位点 将具体的功能基团引入到所述目标肽的C-末端，比如通过溴化氰裂解。
[0055] 编码所述目标肽的DNA序列可以获自天然来源（如基因组DNA)，也可以利用细菌 细胞或其它宿主细胞的密码子偏爱性通过化学合成获得。
[0056] 本发明的一个实施方案提供了一种从基因组DNA中扩增编码具体肽的DNA序列的 方法。通常情况下，设计两个引物以在PCR产物的两端引入两个独特的限制性内切酶切位 点。所述PCR反应在可以控制反应温度的PCR扩增设备上进行。PCR DNA聚合酶，例如Taq 酶、Pfu酶、Phusion DNA聚合酶，被用于PCR反应中，反应条件采用供应商提供的方案。PCR 产物用至少一种限制性内切酶直接消化，或者若有必要，在被限制性内切酶消化前进行清 洗步骤。所述消化反应混合物用DNA纯化方法进行净化。DNA的纯化可以通过使用琼脂糖 凝胶电泳或PCR纯化试剂盒来实现。所述纯化的PCR产物作为编码目标肽的插入物。在一 些实例中，编码所述目标肽的插入物不能从天然来源获得。在该后一种情形中，编码所述目 标肽的DNA片段通过化学合成制备。通常，至少两个寡核苷酸引物是化学合成的，且每一末 端至少含有一个限制性内切酶位点。这两个寡核苷酸在中间区域有至少10个碱基对可以 是互补或重叠的。PCR扩增可以用于通过重叠的寡核苷酸序列生成完整的插入物。
[0057] 编码融合蛋白的DNA序列包含至少四个部分，包括亲和标签的DNA序列、载体蛋白 (超折萱绿色灰光蛋白）的DNA序列、裂解位点的DNA序列和目标狀的DNA序列。典型地， DNA序列片段的排列可以与图2A和图2B中描述的相同。所述亲和标签的DNA序列可以被 插入在融合蛋白DNA序列中的任何位置。该融合蛋白的DNA序列可以被连接到任何的细菌 表达质粒中，以构建表达载体。该表达载体含有至少一个启动子，如lac、T7、Tac、lamda、pL 或pBAD和一个抗生素标记，如氨苄青霉素，卡那霉素或四环素。
[0058] 所构建的表达载体可以被转化到细菌宿主细胞以复制质粒，用于小规模DNA制备 (小量制备）和测序。所述构建体通过DNA测序以对其进行确认，再将所述表达载体转化细 菌宿主细胞以表达所述融合蛋白。含有所述融合蛋白表达载体的细胞可以在存在至少一种 抗生素的LB培养基或基本培养基中培养。该融合蛋白的表达被诱导剂诱导，所述诱导剂例 如IPTG、半乳糖苷、萘啶酸、温度或阿拉伯糖。
[0059] 融合蛋白的纯化是指将该融合蛋白从宿主细胞中分离出来的过程。细胞一般通过 离心或过滤收集。通常将细胞沉淀重悬在含有50mM磷酸盐、IOmM Tris和50mM NaCl的裂 解缓冲液中。所述裂解缓冲液可以包含离散剂，例如尿素或盐酸胍。悬浮的细胞可进一步经 受French Press或超声处理，以彻底破坏细胞。将所述裂解物离心以从其它成分分离出所 需的融合蛋白。在一些情况下，该融合蛋白是以纯包涵体的形式从细胞中分离出来的。所述 包涵体可通过常规技术从粗制细胞裂解物中分离，例如通过离心。所述粗制包涵体可以经 过初步纯化步骤，例如以50mM磷酸盐、ImM EDTA，pH为7. 5的溶液洗一次，然后以含低浓度 离散计例如尿素或盐酸胍的相同缓冲液洗涤至少两次。将纯包涵体溶解在高浓度的离散缓 冲液中，然后进行重折叠。重折叠过程可以通过在生理缓冲液中进行透析所述悬浮的样品， 或通过反相色谱柱除盐，再进行冷冻干燥。在一些情况下，所述融合蛋白以细胞内不溶包涵 体形式产生，但没有设计亲和标签。在这种情况下，在裂解物中的所述融合蛋白通过溶剂提 取粗纯后再用离子交换色谱法进一步纯化。如果有必要，该融合蛋白可通过反相HPLC进行 纯化。在其它情况下，该融合蛋白可以通过亲和色谱法，如作为组氨酸标签结合的Ni-NTA 亲和珠，在天然条件下或在变性条件下进行纯化。
[0060] 在裂解后，所述混合物被用来将所述目标肽从所述载体蛋白分离出来。在一些实 例中，该混合物可以直接用于HPLC纯化。将所述混合物的pH值调节到低于3. 0，在HPLC纯 化之前将样品过滤，以去除固体颗粒。在一些实例中，该混合物用水稀释（如至大约10倍）， 并冷冻以干燥，然后用反相HPLC柱纯化，使用含0. 1 % TFA的乙腈-水梯度。在其他实例中， 该混合物最初通过组氨酸标签亲和色谱法和反相色谱法纯化，以除去盐、载体蛋白、未消化 的融合蛋白以及非特异性消化的肽。最后，将纯的肽冻干，并由质谱进行确认。
[0061] 表1列出了下文示例的一些重组肽，它们在本发明中已经被表达。数据显示，目前 表达系统可以高效地、高产量地产生纯肽。
[0062] 表1所表达的重组肽的实例
[0063]
【主权项】
1. 一种用于表达目标肽的融合载体蛋白。所述融合载体蛋白来源于超折叠绿色荧光蛋 白或其变体。