2. -种具有结构式I中列出的氨基酸序列的融合载体蛋白： T1-A1-T2(I), 其中， T1为不存在、甲硫氨酸、组氨酸标签或者至少一个肽裂解位点； A1为超折萱绿色焚光蛋白； T2为不存在、组氨酸标签或者至少一个肽裂解位点，条件是T1和T2至多有一个不存 在。
3. 权利要求1的融合载体蛋白，其中所述肽裂解位点选自：Met、Cys、Pro、Asn、 Glu、Tyr、Trp、Lys、Arg、Asn-Gly、Asp-Met-Gln-Asp-Ile、Asp-Glu-Val-Asp-Ile、 Leu-Glu-Val-Asp-Ile、Trp-Glu-His-Asp-Ile、Leu-Glu-His-Asp-Ile、 Val-Glu-Ile-Asp-Ile、Val-Glu-His-Asp-Ile、Ile-Glu-Thr-Asp-Ile、 Leu-Glu-Thr-Asp-Ile、Ile-Glu-Ala-Asp-Ile、Asp-Asp-Asp-Asp-Lys、Arg-Gly-Glu-lie、 Arg-Gly-Asp-Ile、Arg-Gly-Asp-Ile、Arg-Gly-Asp-Ala、Ile_Glu-Pr〇-Asp-Ile、 Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln_Gly(SEQ IDNO :3)、Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln_Ser(SEQ ID NO : 5)，以及任何其他蛋白水解位点。
4. 权利要求1的融合载体蛋白，其中所述肽裂解位点选自Met、Lys、Arg、 Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly(SEQ ID N0:3)和 Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Ser(SEQ ID NO ：5) 〇
5. 权利要求1的融合载体蛋白，其中所述组氨酸标签由三个至八个组氨酸残基组成。
6. 权利要求1的融合载体蛋白，其中超折叠绿色荧光蛋白具有如下氨基酸序列：Ser-L ys-Gly-Glu-Glu-Leu-Phe-Thr-Gly-Val-Val-Pr〇-Ile-Leu-Val-Glu-Leu-Asp-Gly-Asp-Va 1-Asn-Gly-His-Lys-Phe-Ser-Val-Arg-Gly-Glu-Gly-Glu-Gly-Asp-Ala-Thr-Asn-Gly-Lys -Leu-Thr-Leu-Lys-Phe-Ile-Cys-Thr-Thr-Gly-Lys-Leu-Pr〇-Val-Pr〇-Trp-Pr〇-Thr-Leu-Val-Thr-Thr-Leu-Thr-Tyr-Gly-Val-Gln-Cys-Phe-Ser-Arg-Tyr-Pr〇-Asp-His-Met-Lys-A rg-His-Asp-Phe-Phe-Lys-Ser-Ala-Met-Pr〇-Glu-Gly-Tyr-Val-Gln-Glu-Arg-Thr-Ile-Se r-Phe-Lys-Asp-Asp-Gly-Thr-Tyr-Lys-Thr-Arg-Ala-Glu-Val-Lys-Phe-Glu-Gly-Asp-Thr -Leu-Val-Asn-Arg-Ile-Glu-Leu-Lys-Gly-Ile-Asp-Phe-Lys-Glu-Asp-Gly-Asn-Ile-Leu-Gly-His-Lys-Leu-Glu-Tyr-Asn-Phe-Asn-Ser-His-Asn-Val-Tyr-Ile-Thr-Ala-Asp-Lys-G ln-Lys-Asn-Gly-Ile-Lys-Ala-Asn-Phe-Lys-Ile-Arg-His-Asn-Val-Glu-Asp-Gly-Ser-Va l-Gln-Leu-Ala-Asp-His-Tyr-Gln-Gln-Asn-Thr-Pr〇-Ile-Gly-Asp-Gly-Pr〇-Val-Leu-Leu -Pr〇-Asp-Asn-His-Tyr-Leu-Ser-Thr-Gln-Ser-Val-Leu-Ser-Lys-Asp-Pr〇-Asn-Glu-Lys-Arg-Asp-His-Met-Val-Leu-Leu-Glu-Phe-Val-Thr-Ala-Ala-Gly-Ile-Thr-His-Gly-Met-A sp-Glu-Leu-Tyr-Lys(SEQ IDN0:1)，或与SEQ IDN0:1 至少 80%，至少 90%，至少 95%， 至少97 %或者至少99 %相同的氨基酸序列。
7. -种包含权利要求1-6任一项限定的融合载体蛋白的融合蛋白，所述融合载体蛋白 连接至至少一个目标肽。
8. 权利要求7的融合蛋白，其中所述目标肽连接至所述融合载体蛋白的N-末端。
9. 权利要求7的融合蛋白，其中所述目标肽连接至所述融合载体蛋白的C-末端。
10. 权利要求7的融合蛋白，其中所述目标肽具有长度10-200个氨基酸的序列。
11. 权利要求7的融合蛋白，其中所述目标肽具有长度20-200个氨基酸的序列。
12. 权利要求7的融合蛋白，其中所述目标肽选自以下肽：可的瑞林、甲状旁腺素、胰高 血糖素样肽及其衍生物艾塞那肽和利拉鲁肽、恩夫韦肽、降血钙素、比伐卢定、齐考诺肽、舍 莫瑞林、生长瑞林、分泌素、替度鲁肽和胰岛素原、水蛭素、生长激素、生长因子、生长激素释 放因子、促肾上腺皮质激素、释放因子、德舍瑞林、去氨加压素、依降钙素、胰高血糖素、亮丙 瑞林、促黄体（生成）激素释放激素、分泌素、生长激素抑制素、促甲状腺激素释放激素、曲 普瑞林、血管活性肠肽、干扰素、甲状旁腺激素、BH3肽、0 -淀粉样变肽或上述肽的片段。
13. 权利要求7的融合蛋白，还包括在所述融合载体蛋白和所述目标肽之间的肽裂解 位点。
14. 权利要求7的融合蛋白，其中所述融合蛋白是分离的。
15. -种编码权利要求7-14任一项的融合蛋白的核酸。
16. 权利要求15的核酸，其中所述核酸是分离的。
17. -种含有权利要求15或16的核酸的表达载体，所述核酸可操作地连接到用于表达 编码所述融合蛋白的所述核酸序列的启动子。
18. 权利要求17的表达载体，其中所述启动子是lac启动子、17启动子、Tac启动子， lamda启动子、pL启动子、trc启动子或pBAD启动子。
19. 一种以权利要求17或18的表达载体转化的宿主细胞。
20. 权利要求19的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌（E. coli)DH5a、DH10b、 ToplO、BL21、JM101、JM105 或者 NM522。
21. 权利要求19的宿主细胞，其中所述宿主细胞来自于大肠杆菌或枯草芽孢杆菌 (B.subtilis)〇
22. 权利要求19的宿主细胞，其中所述宿主细胞是酵母。
23. 权利要求19的宿主细胞，其中所述宿主细胞来自于昆虫。
24. 权利要求19的宿主细胞，其中所述宿主细胞来自于哺乳动物。
25. -种用于产生融合蛋白方法，所述方法包括如下步骤：在适合表达所述表达载体 的条件下培养权利要求19-24任一项限定的宿主细胞，从而产生融合蛋白。
26. 权利要求25的方法，其中所述合适条件包括用于诱导所述宿主细胞表达所述表达 载体的诱导剂。
27. 权利要求26的方法，其中所述诱导剂是阿拉伯糖、IPTG、萘啶酸或温度。
28. 权利要求25的方法，所述方法还包括纯化所产生的融合蛋白的步骤。
29. 权利要求28的方法，其中所述纯化步骤包括乙醇沉淀、离子交换、使用Ni-NTA琼脂 糖树脂亲和纯化中至少一个。
30. 权利要求25的方法，其中对所述融合蛋白进一步进行蛋白水解消化，以从所述融 合蛋白释放所述目标肽。
31. 权利要求30的方法，其中所述蛋白水解消化通过溴化氰、甲酸或HC1来实现。
32. 权利要求30的方法，其中所述蛋白水解消化通过胰蛋白酶、TEV蛋白酶、凝血酶或 肠激酶来实现。
33. 权利要求30的方法，其中将所述释放的目标肽通过凝胶过滤或HPLC进一步纯化。
34. 权利要求1-6任一项限定的融合载体蛋白用于表达目标肽的用途。
35. 权利要求15或16限定的核酸序列用于表达目标肽的用途。
36. 权利要求17或18限定的表达载体用于表达目标肽的用途。
37. 权利要求19-24任一项限定的宿主细胞用于表达目标肽的用途。
【专利摘要】本发明涉及使用源于超折叠绿色荧光蛋白及其变体的新的载体蛋白产生含有10到200个氨基酸残基重组肽的方法。
【IPC分类】C07K19-00, C12N15-70, C12N15-62, C12N15-63
【公开号】CN104619726
【申请号】CN201380016014
【发明人】刘文设, 万为
【申请人】苏州鲲鹏生物技术有限公司
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2013年3月25日
【公告号】US20150051374, WO2013142859A2, WO2013142859A3