基酸是L ;在对应于SEQ ID NO : 2的位点47 的位点处的氨基酸是P ;在对应于SEQ ID NO : 2的位点50的位点处的氨基酸是F ;在对应 于SEQ ID NO :2的位点61的位点处的氨基酸是F ;在对应于SEQ ID NO :2的位点80的位 点处的氨基酸是I ;并且在对应于SEQ ID NO :2的位点156的位点处的氨基酸是V。
[0020] 本文还提供了编码此类多肽的多核苷酸。本文还提供了包含此类多核苷酸的重组 微生物宿主细胞。本文还提供了包含此类多肽的重组微生物宿主细胞。
[0021] 本文提供 了包含 394、396、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、 410、412、413、414、415、416、417、418、419、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、 432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、 451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、 470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、 489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、506、508、510、 511、513、514、518、519、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、 536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、547、549、550、551、552、553、554、555、556、 557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、 576、577、579、580、581、582或583的序列的多核苷酸。在实施例中，本文提供的多核苷酸包 含 SEQ ID NO :393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、 409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、 428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、 447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、 466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、 485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、 504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、 523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、 542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、 561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、 580、581、582、583 或 584 的序列。在实施例中，本文提供的多核苷酸包含SEQIDN0:567、 568、549、544、579、569、513、432或431的序列。本文还提供了包含本文提供的多核苷酸的 重组宿主细胞。
[0022] 在一些实施例中，微生物宿主细胞还包含降低的或消除的乙酰乳酸还原酶活性。 在实施例中，宿主细胞还包含fra2中的至少一个缺失、突变、和/或取代。在实施例中，宿主 细胞还包含下列底物至产物的转化：丙酮酸至乙酰乳酸的转化；乙酰乳酸至2, 3-二羟基异 戊酸的转化；2, 3-二羟基异戊酸至α -酮异戊酸；α -酮异戊酸至异丁醛；以及异丁醛至异 丁醇。在实施例中，具有酮醇酸还原异构酶活性的所述多肽选自SEQ ID No :11、41、和42。 在实施例中，具有酮醇酸还原异构酶活性的所述多肽包含SEQ ID NO :365、366、157、159、 154、377、367、123、42或41的氨基酸序列。在实施例中，所述宿主细胞是酵母宿主细胞。在 实施例中，所述宿主细胞是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)。
[0023] 本文还提供了用于将乙酰乳酸转化为二羟基异戊酸的方法，所述方法包括提供所 述多肽。本文还提供了用于将乙酰乳酸转化为二羟基异戊酸的方法，所述方法包括提供包 含所提供的多肽的微生物宿主细胞；以及使所述多肽与乙酰乳酸接触，其中产生二羟基异 戊酸。本文还提供了生产选自异丁醇、泛酸盐、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、3, 3-苹果酸二甲 酯、和2-甲基-1-丁醇的产物的方法，所述方法包括：提供本文提供的重组宿主细胞，其中 所述重组宿主细胞包含产物生物合成途径；以及使所述微生物宿主细胞在产物由此被生产 的条件下与碳底物接触。在实施例中，所述接触的至少一部分是在厌氧条件下发生。
【附图说明】
[0024] 图1-示出了四种不同的异丁醇生物合成途径。标记为"a"、"b"、"c"、"d"、"e"、 "f"、"g"、"h"、"i"、"j"和"k"的步骤表示下文所述的底物至产物的转化。
[0025] 图 2 显不了来自焚光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens) ( "PF5";SEQ ID NO : 1)的KARI及其变体（"JEA1";SEQ ID NO :2 ;描述于美国专利申请公布2010/0197519中， 该文献以引用方式并入本文）的氨基酸序列的比对。
[0026] 图 3 是 pLH556 (pHR81-PIlv5-Pf5. KARI) (SEQ ID NO :162)的质粒图谱。质粒 PLH556包含针对酵母的2微米复制起点、针对大肠杆菌（E. coli)的pBR322起点、针对在酵 母中的维持的Leu2和Ura3营养缺陷型标记基因、针对在大肠杆菌（E. coli)中的维持的氨 苄青霉素抗性标记基因、和克隆在PmeI和SfiI限制性位点之间的KARI开放阅读框。KARI 启动子是ilv5p，KARI终止子是ilv5t。
[0027] 图4是pBP915(SEQ ID NO:163)的质粒图谱。质粒pBP915包含针对酵母的2微 米复制起点、针对大肠杆菌（E. coli)的pMBl起点、和针对噬菌体Fl的Fl起点。其包含针 对在酵母中的维持的His3营养缺陷型标记基因、和针对在大肠杆菌（E. coli)中的维持的 氨苄青霉素抗性标记基因。来自变异链球菌（S.mutans)菌株UA159的IlvD(DHAD)基因被 克隆在4打11和此《限制性位点之间。丨1 ￥〇启动子是？84?，丨1￥〇终止子是？84丨。还存在 马醇脱氢酶基因，其具有GPMp启动子和ADHt终止子。
[0028] 图 5 是 pBP2090(pHR81-PIlv5p. K9D3. TEFl (M4)p. ilvD)载体（SEQ ID NO :164) 的质粒图谱。质粒PBP2090包含针对酵母的2微米复制起点、针对大肠杆菌（E. coli)的 PBR322起点、针对在酵母中的维持的Leu2和Ura3营养缺陷型标记基因、针对在大肠杆菌 (E. coli)中的维持的氨苄青霉素抗性标记基因、和克隆在PmeI和SfiI限制性位点之间的 KARI开放阅读框。KARI启动子是ilv5p，KARI终止子是ilv5t。该质粒还包含克隆在AflII 和NotI限制性位点之间的来自变异链球菌（S.mutans)菌株UA159的IIvD(DHAD)基因。 iIvD启动子是经修饰的TEFl启动子（TEFl (M4)p)，iIvD终止子是FBAt。
[0029] 图6示出了异丁醇生物合成途径。步骤"a"表示丙酮酸至乙酰乳酸的转化。步骤 "b"表示乙酰乳酸至DHIV的转化。步骤"c"表示二羟基异戊酸（DHIV)至酮异戊酸（KIV) 的转化。步骤"d"表示KIV至异丁醛的转化。步骤"e"表示异丁醛至异丁醇的转化。步骤 "f"表示乙酰乳酸至2, 3-二羟基-2-甲基丁酸（DHMB)的转化。
[0030] 图7是在所指示的实例中与作为SEQ ID NO :163给出的质粒联合使用的载体的示 例（SEQ ID NO :347;包含针对KARI变体65139的编码序列）的质粒图谱。该质粒与图3 中所示的质粒相似，但Ura3基因被一个沉默突变修饰，以消除其中的BsmBI位点。
[0031] 图8是在所指示的实例中使用的载体的示例（SEQ ID NO :349 ;包含针对KARI变 体76437 "R9E8"的编码序列）的质粒图谱。该质粒与图5中所示的质粒相似，但Ura3基 因被一个沉默突变修饰，以消除其中的BsmBI位点。
[0032] 图9示出了 Pf5 KARI二聚体的同源性模型。在单体中的一个中示出（箭头）了 位点 113、1152 和 S157。
[0033] 图10示出了 Pf5 KARI的同源性模型，仅单体A。显示了 N-结构域（残基1-181) 和C-结构域（残基182-327)。在图10A中，显示了分子间二聚体界面中的位点M238、Y239、 E264、N267、A268、Q272、A277、R280、Y286、I291、S292、M301、S322 的位置。在图 10B 中，显 示了结构域间界面区域中的位点Y113、N114、N114、I291、S292、和A295的位置。
[0034] 图IlA示出了模型化的核苷酸结合区域的部分，P47、P50、V53、T80、和L88的位 点。图IlB示出了 N-结构域的表面上两个短转折（位点64-73)的α螺旋上的位点68、 69、71和72。该模型中的残基76通过疏水相互作用与残基70的侧链相互作用。该短螺旋 的N-末端部分被包装为与模型化的核苷酸结合区域的残基47部分的主链相对。
[0035] 图12示出了 N-结构域疏水性桥区域中的位点C33、L61、1127、1152、和V171。
【具体实施方式】
[0036] 除非另有定义，否则本文所用的所有科技术语的含义与本发明所属领域的普通技 术人员通常理解的一样。如发生矛盾，以本专利申请（包括其定义）为准。此外，除非上下 文另有所需，单数术语将包括复数并且复数术语将包括单数。本文提及的所有公布、专利和 其他参考文献出于各种目的全文以引用方式并入本文，如同每一单独的公布或专利申请均 特定且个别地以引用方式并入一样，除非仅专利或专利申请的特定部分被提及以引用方式 并入本文。
[0037] 下文公开了合适的方法和材料，虽然在本发明的实施或试验过程中也可以使用与 本文所公开的那些类似或等同的方法和材料。材料、方法和实例仅是例示性