的并且不旨在 进行限制。根据发明【具体实施方式】和权利要求，本发明的其他特点和优点将显而易见。
[0038] 为了进一步明确本发明，提供下列术语、缩写和定义。
[0039] 应当理解，"来源于"在关于本文所公开的多肽时涵盖了基于所指示的生物中存在 的KARI的氨基酸序列合成的序列以及直接从所述生物的遗传物质克隆的那些。
[0040] 如本文所用，术语"包含"、"包括"、"具有"、"含有"或它们的任何其他变型将被理 解为是指包括指定的整数或整数组但不排除任何其它整数或整数组并且旨在是非排他性 的或端值开放性的。例如，包含一系列元素的组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备不必 仅限于那些元素，而可以包括其它未明确列出的元素，或此类组合物、混合物、工艺、方法、 制品或设备固有的元素。此外，除非另外相反指明，否则"或"是指包含性的或，而不是指排 它性的或。例如，以下中任一者均满足条件A或B :A是真的（或存在的）且B是假的（或 不存在的）、A是假的（或不存在的）且B是真的（或存在的）、以及A和B都是真的（或 存在的）。
[0041] 如本文所用，如整个说明书和权利要求中所使用的，术语"由...组成"或诸如 "由...组成的"的变型指示包括任何列举的整数或整数组，但是没有另外的整数或整数组 能够被加入到指定的方法、结构、或组合物中。
[0042] 如本文所用，如整个说明书和权利要求中所使用的，术语"基本上由...组成"或 诸如"基本上由...组成的"变型指示包括任何列举的整数或整数组，并且任选地包括未 显著改变指定的方法、结构或组合物的基本或新颖特性的任何列举的整数或整数组。参见 Μ. P. E. P. § 2111. 03〇
[0043] 同样，涉及元素或组分实例（即次数）的数目在本发明元素或组分前的不定冠词 "一个"或"一种"旨在是非限制性的。因此，应将"一个"或"一种"理解为包括一个或至少 一个，并且元素或组分的词语单数形式也包括复数指代，除非有数字明显表示单数。
[0044] 如本文所用，术语"发明"或"本发明"是非限制性术语，并且不旨在指本发明的任 何单独实施例，而是涵盖如（所提出的或以后所修订的和补充的）权利要求中或本说明书 中所述的所有可能的实施例。
[0045] 如本文所用，修饰本发明的成分或反应物的量使用的术语"约"是指可以通过例如 以下方式而发生的用数字表示的量的变化：在真实世界中用于产生浓缩物或溶液的一般测 量和液体处理操作；通过这些操作中非故意的误差；用于制备组合物或执行方法的成分的 制造、来源或纯度中的差异；等。术语"约"还包括由于产生自特定起始混合物的组合物的 不同平衡条件而不同的量。无论是否通过术语"约"来修饰，权利要求包括量的等同量。在 一个实施例中，术语"约"指在报告数值的10%范围内，或在报告数值的5%范围内。
[0046] 术语"异丁醇生物合成途径"是指产生异丁醇的酶途径。例如，某些异丁醇生物合 成途径公开于美国专利7, 851，188中，该文献全文以引用方式并入本文。某些异丁醇生物 合成途径在图1中示出并如本文所述。有时"异丁醇生物合成途径"与"异丁醇生产途径" 同义地使用。
[0047] 本文所用术语"丁醇"是指2- 丁醇、1- 丁醇、异丁醇或它们的混合物。异丁醇也被 称为2-甲基-1-丙醇。
[0048] 包含"工程化的醇生产途径"（诸如工程化的丁醇或异丁醇生产途径）的重组宿主 细胞是指包含经修饰的途径的宿主细胞，该途径以与宿主细胞中通常存在的途径不同的方 式生产醇。此类差异包括生产通常宿主细胞不生产的醇，或者提高产量或更有效地生产。
[0049] 如本文所用，术语"异源的生物合成途径"是指用于生产产物的酶途径，在其中酶 中的至少一种不是对于包含该生物合成途径的宿主细胞而言内源性的。
[0050] 如本文所用，术语"提取剂"是指能够用于从发酵液体培养基中提取丁醇的一种或 多种溶剂。
[0051] 如本文所用，术语"有效滴度"是指每升发酵培养基通过发酵产生的特定醇（例如 丁醇）的总量。丁醇的总量包括：（i)发酵培养基中的丁醇量；（ii)由有机萃取剂回收的丁 醇量；以及（iii)如果利用汽提，由气相回收的丁醇量。
[0052] 如本文所用，术语"有效速率"是指每升发酵培养基通过发酵每小时产生的丁醇的 总量。
[0053] 如本文所用，术语"有效收率"是指生物催化剂消耗每单位可发酵碳底物产生的丁 醇的量。
[0054] 如本文所用，术语"分离"与"回收"同义，是指从初始混合物中去除化合物以获得 纯度或浓度比初始混合物中的化合物纯度或浓度更高的化合物。
[0055] 如本文所用，术语"水相"是指通过使发酵液体培养基接触与水不混溶的有机提取 剂而获得的两相混合物中的水相。在本文所述包括发酵提取的方法的一个实施例中，术语 "发酵液体培养基"具体地指在双相发酵提取中的水相。
[0056] 如本文所用，术语"有机相"是指通过使发酵液体培养基接触与水不混溶的有机提 取剂而获得的双相混合物中的非水相。
[0057] 如本文所用，术语"H)C-"、"PDC敲除"、或"PDC-KO"是指具有灭活或降低编码丙酮 酸脱羧酶（roc)的基因的表达的基因修饰，从而使该细胞基本上或完全缺乏丙酮酸脱羧酶 酶活性的细胞。如果所述细胞具有多于一种的表达的（活性的）PDC基因，则活性PDC基因 中的每个能够被灭活或具有最小的表达从而产生roc-细胞。
[0058] 术语"多核苷酸"旨在包括单数的核酸以及复数的核酸，并且是指核酸分子或构建 体，例如，信使RNA (mRNA)或质粒DNA (pDNA)。多核苷酸能够包含全长CDNA序列的核苷酸序 列，或其片段，包括非翻译的5'和3'端序列和编码序列。所述多核苷酸能够由任何多核 糖核酸或多脱氧核糖核酸构成，其可为非改性的RNA或DNA，或改性的RNA或DNA。例如，多 核苷酸能够由如下构成：单链和双链DNA(DNA即为单链和双链区域的混合物）；单链和双链 RNA (RNA即为单链和双链区域的混合物）；包含DNA和RNA的杂合分子，其可为单链或，更典 型地双链或单链和双链区域的混合物。"多核苷酸"包含了化学地、酶促地、或代谢地改性的 形式。
[0059] 多核苷酸序列可意为"分离的"，其中它已从其天然的环境中移除。例如，包含在载 体中的编码具有二羟酸脱水酶活性多肽或多肽片段的异源性多核苷酸，出于本发明的目的 可被认为是分离的。分离的多核苷酸的另一个例子包括维持在异源宿主细胞中的重组多核 苷酸或溶液中的经纯化的（部分地或基本上）多核苷酸。根据本发明分离的多核苷酸或核 酸还包括此类合成生产的分子。DNA聚合物形式的分离的多核苷酸片段可以由cDNA、基因 组DNA或合成DNA中的一个或多个片段构成。
[0060] 术语"NAD(P)H消耗测定法"是指用于确定KARI酶的特异性活性的酶测定法，包 括从酶反应测量KARI辅因子，NAD(P)H的消失。此类测定描述于Aulabaugh和Schloss， Biochemistry 29 :2824-2830,1990中，该文献全文以引用方式并入本文。
[0061 ]术语 "NAD ⑵ H" 是指 NADH 或 NADPH。
[0062] "KARI"是酮醇酸还原异构酶的缩写。
[0063] 术语"紧邻"当指KARI酶的各种氨基酸残基相对于NADPH的腺苷2'-磷酸酯的 位置时，是指所述酶的结构的三维模型中位于与该酶结合的NADPH的腺苷W -磷酸酯的磷 原子约4.5 A内的氨基酸。
[0064] 术语"酮醇酸还原异构酶"（缩写为"KARI"）和"乙酰羟酸异构还原酶"将可互 换使用，并指能够催化（S)-乙酰乳酸至2, 3-二羟基异戊酸的反应、被分类为EC编号EC I. 1. 1.86 (Enzyme Nomenclature 1992，Academic Press，San Diego)的酶。KARI 存在于多 种生物体中，跨物种的氨基酸序列比较已经揭示该酶具有两种类型：短型（I类）存在于真 菌和大多数细菌中，长型（II类）一般存在于植物中。I类KARI通常具有介于330-340个 之间的氨基酸残基。长型KARI酶具有约490个氨基酸残基。然而，一些细菌诸如大肠杆菌 (Escherichia coli)具有长型酶，其中所述氨基酸序列略为不同于存在于植物中的氨基酸 序列。KARI由ilvC基因编码，是基本培养基中大肠杆菌（E. coli)和其他细菌生长的必需 酶。II类KARI -般由225个残基的N-末端结构域和287个残基的C-末端结构域组成。 包含辅因子结合位点的N-末端结构域具有α β结构，类似于存在于其他吡啶核苷酸依赖 的氧化还原酶中的结构域。C-末端结构域基本上完全由α螺旋组成。
[0065] KARI描述于例如美国专利7, 910, 342和8, 129, 162以及美国专利申请公布 2010/0197519中，全部这些文献均全文以引用方式并入本文。
[0066] 酮醇酸还原异构酶（KARI)在用于利用工程化的微生物生产异丁醇的途径中是有 用的（美国专利7, 851，188和7, 993, 889,这些文献全文以引用方式并入本文）。
[0067] 能够利用NADH的KARI能够在通常使用的微生物细胞中利用通过现有的糖酵解途 径和其他代谢途径产生的NADH，并可导致改善的异丁醇生产。Rane等人（Arch. Biochem. Biophys.，338 :83-89,1997)讨论了从大肠杆菌（Ε· coli.)分离的酮醇酸还原异构酶的辅 因子转换。美国专利申请公布2009/0163376和2010/0197519(上述文献中的每一个均 全文以引用方式并入本文）描述了能够使用NADH的KARI酶的变体。美国专利申请公布 2010/0143997(该文献全文以引用方式并入本文）描述了具有改善的针对NADH的K m值的 大肠杆菌（E. coli.)变体。
[0068] 术语"酮醇酸还原异构酶活性"和"KARI活性"是指催化（S)-乙酰乳酸至2,3_二 羟基异戊酸的底物至产物的转化的能力。
[0069] 术语"乙酰乳酸合酶"是指催化丙酮酸至乙酰乳酸和CO2的转化的酶。乙酰乳酸 具有两种立体异构体（(R)和（S));该酶偏好由生物系统产生的（S)-异构体。已知的某 些乙酰乳酸合酶为 EC 编号 2.2.1. 6(Enzyme Nomenclature 1992，Academic Press，San Diego)。这些酶可得自多种来源，包括但不限于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)(SEQ ID NO :165)、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae) (SEQ ID NO :166)和乳酸乳球菌 (Lactococcus lactis)〇
[0070] 术语"乙酰羟酸脱水酶"是指催化2, 3-二羟基异戊酸至α -酮异戊酸的转化的酶。 已知的某些乙酰羟酸脱水酶为EC编号4. 2. 1. 9。这些酶可得自多种微生物，包括但不限于 大肠杆菌（E. coli)、啤酒酵母（S. cerevisiae)、海沼甲烧球菌（M. maripaludis)、枯草芽孢 杆菌（B.subtilis)、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis) (SEQ ID NO :167)、和变异链球菌 (Streptococcus mutans)(SEQ ID N0：168)〇
[0071] 术语"支链α -酮酸脱羧酶"指催化α -酮异戊酸至异丁醛和CO2的转化的酶。 已知的某些支链α -酮酸脱羧酶为EC编号4. I. 1. 72,并且可得自多种来源，包括但不限 于乳酸乳球菌（