根据权利要求9或10所述的多肽，其中： a. 在对应于SEQ ID NO : 2的位点24的位点处的氨基酸是F ; b. 在对应于SEQ ID NO : 2的位点33的位点处的氨基酸是L ; c. 在对应于SEQ ID NO : 2的位点47的位点处的氨基酸是P ; d. 在对应于SEQ ID NO : 2的位点50的位点处的氨基酸是F ; e. 在对应于SEQ ID NO :2的位点61的位点处的氨基酸是F ; f. 在对应于SEQ ID NO : 2的位点80的位点处的氨基酸是I ;并且 g. 在对应于SEQ ID NO : 2的位点156的位点处的氨基酸是V。
12. 根据权利要求9-11中任一项所述的多肽，所述多肽与SEQ ID N0:41、42、33、34、 35、36、37、38、39、40、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、 62、63或64具有至少约95%或至少约99%的同一性。
13. 多肽，所述多肽具有酮醇酸还原异构酶活性并且包含 与SEQ ID NO :41至少约85%、至少约95%、或至少约99%的同一性 和下列取代中的至少一种：M301I、Y239H、Y113F、S322A、A71K、N114G、A329R、A69T、 N114S、G72W、A295V、E264K、R280D、A329E、S157T、M238I、Q272T、K335M、R280H、或它们的组 合； 或此类多肽的活性片段。
14. 根据权利要求13所述的多肽，其中在对应于SEQ ID NO :2的位点52的位点处的 氨基酸是D或E。
15. 根据权利要求13-14中任一项所述的多肽，其中： a. 在对应于SEQ ID NO : 2的位点24的位点处的氨基酸是F ; b. 在对应于SEQ ID NO : 2的位点33的位点处的氨基酸是L ; c. 在对应于SEQ ID NO : 2的位点47的位点处的氨基酸是P ; d. 在对应于SEQ ID NO : 2的位点50的位点处的氨基酸是F ; e. 在对应于SEQ ID NO :2的位点61的位点处的氨基酸是F ; f. 在对应于SEQ ID NO : 2的位点80的位点处的氨基酸是I ;并且 g. 在对应于SEQ ID NO : 2的位点156的位点处的氨基酸是V。
16. 根据权利要求13-15中任一项所述的多肽，所述多肽与SEQ ID NO : 157、159、152、 123、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、116、118、 119、120、121、124、128、129、131、132、133、134、136、137、138、139、140、141、142、143、144、 146、147、148、149、150、151、153、154、155、160 或 161 具有至少约 95%或至少约 99% 的同一 性。
17. 多肽，所述多肽具有酮醇酸还原异构酶活性并且包含 与SEQ ID NO :346至少约85%、至少约95%、或至少约99%的同一性和下列取代中的 至少一种：A68E、I152V、Y286F、和 A336R。
18. 多核苷酸，所述多核苷酸编码根据前述权利要求中任一项所述的多肽。
19. 多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO :2至少约80%的同一性、至少约85%、至少约 90%、至少约95%、或至少约99 %的同一性和在下列位点中的至少一个处的取代：位点 I13、V53、A68、A69、A71、G72、V76、S86、L88、K99、Y113、N114、V117、I127、I152、S157、V171、 M238、Y239、E264、N267、A268、Q272、R275、A277、R280、Y286、I291、S292、A295、M301、R306、 S322、A329、K335 或A336。
20. 重组微生物宿主细胞，所述重组微生物宿主细胞包含根据权利要求1-17或19中任 一项所述的多肽。
21. 根据权利要求20所述的重组微生物宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含降低的或 消除的乙酰乳酸还原酶活性。
22. 根据权利要求21所述的重组微生物宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含fra2中的 至少一个缺失、突变、和/或取代。
23. 根据权利要求20-22中任一项所述的重组微生物宿主细胞，所述宿主细胞还包含 下列底物至产物的转化： a. 丙酮酸至乙酰乳酸 b. 2, 3-二羟基异戊酸至a -酮异戊酸； c.a -酮异戊酸至异丁醛；以及 d. 异丁醛至异丁醇。
24. 根据权利要求23所述的重组微生物宿主细胞，其中所述具有酮醇酸还原异构酶活 性的多肽选自SEQ ID No :11、41、和42。
25. 根据权利要求20-24中任一项所述的重组微生物宿主细胞，其中所述宿主细胞是 酵母宿主细胞。
26. 根据权利要求25所述的重组微生物宿主细胞，其中所述宿主细胞是酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)〇
27. 用于使乙酰乳酸转化为二羟基异戊酸的方法，所述方法包括： a. 提供包含根据权利要求1-17或19中任一项所述的多肽的微生物宿主细胞； b. 使所述多肽与乙酰乳酸接触，其中二羟基异戊酸被生产。
28. 生产产物的方法，所述产物选自异丁醇、泛酸盐、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、3， 3-苹果酸二甲酯、和2-甲基-1-丁醇或它们的组合，所述方法包括： a. 提供根据权利要求20-26中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞包 含产物生物合成途径；以及 b. 使所述微生物宿主细胞在产物由此被生产的条件下与碳底物接触。
29. 根据权利要求28所述的方法，其中所述接触的至少一部分是在厌氧条件下发生。
30. 组合物，所述组合物包含权利要求28的一种或多种产物。
31. 根据权利要求30所述的组合物，其中所述产物是异丁醇或异丁醇和2-甲基-1- 丁 醇。
32. 根据权利要求30或31所述的组合物，其中所述组合物与烃燃料混合。
33. 根据权利要求30或31所述的组合物，其中所述组合物是化学溶剂或用于其他化学 应用的底物。
34. 根据权利要求18所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含394、396、398、399、400、 401、402、403、404、405、406、407、408、410、412、413、414、415、416、417、418、419、422、423、 424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、 443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、 462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、 481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、 500、501、502、503、504、506、508、510、511、513、514、518、519、521、522、523、524、525、526、 527、528、529、530、531、532、533、534、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、547、 549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、 568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、579、580、581、582、或 583 的序列。
35. 多核苷酸，所述多核苷酸包含 SEQ ID N0:393、394、395、396、397、398、399、400、 401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、 420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、 439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、 458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、 477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、 496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、 515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、 534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、 553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、 572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、或 584 的序列。 36?多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ ID勵：567、568、549、544、579、569、513、432或 431的序列。
37. 重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含根据权利要求34-36中任一项所述的多核 苷酸。
38. 根据权利要求37所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞产生异丁醇。
39. 根据权利要求38所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞是酵母宿主细胞。
40. 根据权利要求37-39中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含降 低的或消除的乙酰乳酸还原酶活性。
41.根据权利要求37-40中所述的重组微生物宿主细胞，其中所述宿主细胞还包含 fra2中的至少一个缺失、突变、和/或取代。
【专利摘要】本文提供了具有酮醇酸还原异构酶活性的多肽以及包含此类多肽的微生物宿主细胞。本文所提供的多肽可用于生物合成途径中，包括但不限于异丁醇生物合成途径。
【IPC分类】C12N9-04
【公开号】CN104619835
【申请号】CN201380036539
【发明人】S.戈维达拉詹, Y.李, D-I.廖, D.P.奧基菲, J.S.明舒尔, S.C.罗斯曼, A.V.托比亚斯
【申请人】布特马斯先进生物燃料有限责任公司
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2013年5月10日
【公告号】CA2873109A1, EP2847326A2, US20140051133, WO2013176909A2, WO2013176909A3