体实施方式】
[0042] 下面结合附图对本发明作更进一步的说明。
[0043] 实施例1 :AlVg全长基因的获得
[0044] 采用TRIzol法提取绿盲蝽总RNA，选择电泳图谱良好并且0D260/0D280值在 1. 8~2. 0之间的总RNA样品合并进行mRNA的纯化，反转录合成第一链cDNA，PCR反应 体系为：〇? 5 y g总RNA，0. 5 y 1 01ig〇-dT18,2 y 1 5X反应缓冲液，2 y 1 lOmM dNTP，40U RNasin，200U SuperscriptII，加ddH20至10 yl ;PCR反应参数为：42°C30min，75°C30min， 4°C5min。根据已知昆虫Vg基因的保守序列设计适用于PCR扩增引物AlVg-lF^ -CGTTG GTAGCCGCATGAAC-3'）及AlVg-lR(5'-GAACTGCTGCTGGAACTGCTG-3')，获得AlVg基因保 守序列，该保守序列参见序列表中的SEQ ID NO: 19, PCR反应体系为：2.5yl 10 X反应缓 冲液，2 4 12511111%2+，21111〇1111(1阶13,0.51111&9口1118〇嫩聚合酶，11111〇1^上游引物 AlVg-1-F，lyl 10yM下游引物AlVg-1-R，cDNA模板lyl，加ddH20至25yl ;PCR反应参 数为：94°〇51^11;941：308,591：308,721：1208,40个循环 ；721：继续延伸10111111;在根据获 得的AlVg基因的保守序列设计RACE引物AlVg-race-5'R1 (5'-ACTACTGCTGCTGCTGCTGCT GGAGCT-3r ),AlVg-race-5,R2(5r -GAACTGCTGCTGGAACTGCTGGAGCTATC-3r ),AlVg-race -5，Fl(5' -CGTTGGTAGCCGCATGAACCTCACTCT-3' )、AlVg-race-5'F2(5'-GCAGCTCCAACAG TGCTTCCAACTCAAC-3 ^ )，扩增方法具体参见Clontech公司的cDNA末端的快速扩增（RACE) 试剂盒的方法进行，？〇?反应参数为：941：3〇8,7〇1：18〇8,5个循环；941：3〇8,7〇1：3〇8， 72°〇18〇8,5个循环 ；94°0 3〇8,681：3〇8,721：18〇8,721：继续延伸1〇111111。电泳结果显示 PCR扩增拼接后，利用AlVg开放阅读框引物AlVg-2F(5' -ATGAAGITGACACCGITTCTCT-3') 及AlVg-2RC-TCAAGCTTTGCAGCGAGA-3')，得到与预期大小5976bp相符的条带（图1)。 将？〇?产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳分离和胶回收纯化目的0嫩，与？6￡1^^ &^载体进行 连接，转入大肠杆菌DH5a，挑选单菌落培养，经菌落PCR鉴定为阳性的菌液及序列测定正 确的进行下一步AlVg蛋白特异性肽链表达载体构建。
[0045] 结论：AlVg基因0RF框包含5976个碱基，编码1991个氨基酸，预测分子量 218.32kDa〇
[0046] 实施例2 :AlVg蛋白特异性肽链cDNA克隆
[0047] 根据AlVg基因全长序列在国际权威基因数据库NationalCenterfor BiotechnologyInformation(NCBI)预测AlVg蛋白特异性肽链cDNA序列，碱基如SEQID NO:3所示、氨基酸序列见SEQIDNO:4,并设计PCR扩增引物AlVg-3FC-CATATGCAAATC CAATCTCAACGT-3 '）及A1Vg-3R(5 ' -TCTAGATCAAGCTTTGCAGCGAG-3，），获得A1Vg蛋白特 异性肽链基因序列，PCR反应体系为：2. 5yl10X反应缓冲液，2yl25mMMg2+，2yllOmM dNTP，0.5ylTaqplusDNA聚合酶，lyl10yM上游引物AlVg-l-F，lyl10yM下游引 物AlVg-l-R，cDNA模板 1y1，加ddH20 至 25y1;PCR反应参数为：94°C5min;94°C30s， 60.5°0 308,72°0 608,40个循环；721：继续延伸10111111。电泳结果显示？〇?扩增拼接后，得 到与预期大小789bp相符的条带（图2)。将PCR产物经1. 2%琼脂糖凝胶电泳分离和胶回 收纯化目的DNA，与pGEM-TEasy载体进行连接，转入大肠杆菌DH5a，挑选单菌落培养，经菌 落PCR鉴定为阳性的菌液及序列测定正确的进行下一步表达载体构建。
[0048] 结论：PCR结果包含789个碱基，其中包含AlVg蛋白特异性肽链774个碱基，编 码258个氨基酸和一个氨基酸终止密码子；此外，PCR结果在AlVg蛋白特异性肽链的基础 上，在两端外接Ndel、Xbal单酶切位点，并在起始端外加氨基酸起始密码子ATG;此段特异 性肽链序列最大特点是沿用了AlVg尾端碱基终止序列TGA，并以昆虫Vg蛋白保守的von Willebrandfactor(VWF)结构域及保守的连续氨基酸序列DGXR及GL/ICG为基础设计，加 强后续Vg蛋白抗体的特异性，预测分子量28. 70kDa。
[0049] 实施例3 :AlVg蛋白特异性肽链DNA原核表达载体的构建
[0050] 含有AlVg蛋白特异性肽链基因T载体的原核表达载体构建方法为：将上述测序 正确连入pGEM-TEasy的载体及pCznl均用限制性内切酶Ndel和Xbal双酶切，进行连接。 酶切体系为：2种限制性内切酶各1. 0y1，lOXBuffer缓冲液2. 0y1，带有合适酶切位点 的基因片段10.0U1，用ddH20补足至20y1，37°C水浴3h。连接体系为：酶切回收后的载 体 5.0yl，基因片段lO.Oyl，T4DNA连接酶 1.0yl，10XBuffer缓冲液 2.0yl，用ddH20 补足至20y1，16°C反应12~16h，连接成功后的酶切图谱见图4。连接产物转化大肠杆菌 BL21 (DE3)后采用PCR筛选阳性克隆。将鉴定正确的重组质粒命名为pCznl-AlVgl转化到 大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞后涂布到含卡那霉素（50yg/mL)的平板上，37°C，220rpm/ min培养过夜；从转化后培养过夜的平板上挑单克隆到10ml含50yg/ml卡那霉素的LB 培养基中，37°C摇床中振荡培养过夜；次日将菌液按1%的比例接种到LB液体培养基（含 50yg/mL卡那霉素）中，37°C摇床中培养2-3h，使菌液的0D6QQ达到0. 6-0. 8之间。取出lml 培养物，l〇〇〇〇g室温离心2min，弃上清，用100y1 1X上样缓冲液重悬菌体沉淀；向剩余的 培养物中加入IPTG至终浓度为0. 5mM，37°C220rpm振摇12h，诱导靶标载体融合蛋白表达； 取出lml培养物，12000g室温离心2min，弃上清，用100y1 1X上样缓冲液重悬菌体沉淀， 进行10%SDS-PAGE电泳检测（图5)。
[0051] 结论：经37°C，0. 5mMIPTG诱导12h后AlVg特异性肽链基因可在pCznl载体中进 行高效表达，主要以包涵体形式存在。
[0052] 实施例4 :AlVg蛋白特异性肽链变性和复性及蛋白的纯化
[0053] 靶标融合蛋白的提取及纯化：大量培养经SDS-PAGE电泳检测后含有靶标载体表 达的BL21(DE3)菌体。将诱导表达后的培养菌液低温4°C离心6000g，10min，菌体沉淀重 悬与20ml裂解buffer(包含20mMTris-HCl、lmMPMSF和细菌蛋白酶抑制剂cocktail混 合液，pH8. 0)，超声破碎（功率400W，工作4s，间歇8s，共20min);将超声破碎的细胞裂解 液4°C10000g离心20min，收集沉淀；使用包涵体洗涤液（20mMTris，lmMEDTA，2M尿素，1M NaCl，l%TritonX-100，pH8. 0)洗涤包涵体3次；用溶解缓冲液（20mMTris，5mMDTT，8M尿 素pH8. 0)，按一定比例溶解包涵体，4度放置过夜。室温，15000rpm离心15min，将包涵体溶 解液滴加到20mMTris，pH8. 0缓冲液逐步成倍梯度稀释，缓慢搅拌；至尿素浓度达到0. 5M 时，将蛋白溶液装入透析袋于4°C在20mMPBS，pH7. 4中透析过夜，进行10%SDS-PAGE电 泳检测（图6)。
[0054] 结论：通过变复性的方式，重溶，纯化获得靶标蛋白，电泳检测为目的蛋白，并呈 现单一条带。
[0055] 实施例5 :AlVg蛋白特异性肽链抗体制作
[0056] 动物免疫：将上一步骤纯化的靶标蛋白进行BCA蛋白浓度测定，免疫2只新西兰 白兔（2-2. 5KG