60 U/g。
[0027]考察上述共固定化漆酶与介体的磁性纳米粒子在降解染料废水中的应用效果，选取酸性品红染料，250mL锥形瓶中加入500 mg/L的酸性品红染料5mL、10mg上述制备的共固定化磁性纳米粒子和95 mL 50 mM pH4.5的乙酸-乙酸钠缓冲，总反应体系为100mL。40°C下置于10rpm恒温震荡仪中反应，间隔2 h测定最大吸收波长处吸光值的变化。脱色率= (1-AAtl) *100%，Atl为脱色反应前溶液吸光值，A为脱色反应后溶液吸光值，所有脱色反应均重复3次取平均，计算脱色率达70.05%。而在没有TEMPO的参与下，仅加入同等酶活力的游离漆酶，脱色率仅有3.13%。
[0028]实施例3
氨基硅烷化磁性纳米粒子共固定化漆酶和介体系统的制备方法，包括如下步骤:
(OFe3O4磁性纳米粒子的制备:将0.02 mo I FeCl 2和0.04 mo I FeCl 3溶于10mL去离子水中，在队保护坏境、机械搅拌、70° C水浴的条件下加入3 mo I/L的NaOH溶液250mL，滴加完毕后持续搅拌I h。在外加磁场的作用下将黑色产物分离出来，并用去离子水清洗直至产物为中性，将得到的Fe3O4纳米粒子置于7 %的四甲基氢氧化铵(TMAOH)水溶液中静置2 h，用水洗涤3-5次备用。
[0029](2)Fe304磁性纳米粒子表面修饰APTES:取I g制备得到的Fe 304磁性纳米粒子置于150 mL乙醇/水(体积比1:1)溶液中，然后加入2 mL APTES，50°C，搅拌反应10h。反应产物用去离子水清洗3-5次后，真空干燥，得到表面氨基硅烷化磁性纳米粒子。
[0030](3)介体的固定化:取I g制备得到的氨基硅烷化磁性纳米粒子置于质量浓度为2%的戊二醛溶液中静置2h，去离子水洗数次以除去多余的戊二醛。加入2 mmol4-NH2-TEMP0，室温下震荡反应4h，反应结束后，分离出产物，水洗，得到接枝了介体的纳米粒子。
[0031](4)漆酶的固定:取20 U漆酶加10 mL50 mM pH 4.5的乙酸-乙酸钠缓冲中，再加入100 mg接枝了介体的纳米粒子，35° C震荡反应4h后，50 mM pH 4.5的乙酸-乙酸钠缓冲清洗数次，以洗去未固定的酶，置于4°C冰箱备用，得到漆酶与介体共固定化的磁性纳米粒子，即氨基娃烧化磁性纳米粒子共固定化漆酶和介体系统。每Ig共固定化漆酶与介体的磁性纳米粒子中固定有0.4mmol介体，固定化后的漆酶酶活为120 U/g。
[0032]考察上述共固定化漆酶与介体的磁性纳米粒子在降解染料废水中的应用效果，选取碱性品红染料，250mL锥形瓶中加入500 mg/L的酸性品红染料5mL、10mg上述制备的共固定化磁性纳米粒子和95 mL 50 mM pH4.5的乙酸-乙酸钠缓冲，总反应体系为100mL。40°C下置于10rpm恒温震荡仪中反应，间隔2 h测定最大吸收波长处吸光值的变化。脱色率= (1-AAtl) *100%，Atl为脱色反应前溶液吸光值，A为脱色反应后溶液吸光值，所有脱色反应均重复3次取平均，计算脱色率达75.05%。而在没有TEMPO的参与下，仅加入同等酶活力的游离漆酶，脱色率仅有4.43%。
[0033]实施例4
氨基硅烷化磁性纳米粒子共固定化漆酶和介体系统的制备方法，包括如下步骤:
(OFe3O4磁性纳米粒子的制备:将0.02 mo I FeCl 2和0.04 mo I FeCl 3溶于10mL去离子水中，在队保护坏境、机械搅拌、70° C水浴的条件下加入3 mo I/L的NaOH溶液250mL，滴加完毕后持续搅拌I h。在外加磁场的作用下将黑色产物分离出来，并用去离子水清洗直至产物为中性，将得到的Fe3O4纳米粒子置于7 %的四甲基氢氧化铵(TMAOH)水溶液中静置
2h，用水洗涤3-5次备用。
[0034](2)Fe304磁性纳米粒子表面修饰APTES:取I g制备得到的Fe 304磁性纳米粒子置于150 mL乙醇/水(体积比1:1)溶液中，然后加入2 mL APTES，50°C，搅拌反应10h。反应产物用去离子水清洗3-5次后，真空干燥，得到表面氨基硅烷化磁性纳米粒子。
[0035](3)介体的固定化:取I g制备得到的氨基硅烷化磁性纳米粒子置于质量浓度为2%的戊二醛溶液中静置2h，去离子水洗数次以除去多余的戊二醛。加入I mmol4-NH2-TEMP0，室温下震荡反应4h，反应结束后，分离出产物，水洗，得到接枝了介体的纳米粒子。
[0036](4)漆酶的固定:取25 U漆酶加10 mL pH50 mM pH 4.5的乙酸-乙酸钠缓冲中，再加入100 mg接枝了介体的纳米粒子，35° C震荡反应4h后，50 mM pH 4.5的乙酸-乙酸钠缓冲清洗数次，以洗去未固定的酶，置于4°C冰箱备用，得到漆酶与介体共固定化的磁性纳米粒子，即氨基硅烷化磁性纳米粒子共固定化漆酶和介体系统。每Ig共固定化漆酶与介体的磁性纳米粒子中固定有0.22mmol介体，固定化后的漆酶酶活为160 U/g。
[0037]考察上述共固定化漆酶与介体的磁性纳米粒子在降解染料废水中的应用效果，选取碱性品红染料，250mL锥形瓶中加入500 mg/L的酸性品红染料5mL、10mg上述制备的共固定化磁性纳米粒子和95 mL 50 mM pH4.5的乙酸-乙酸钠缓冲，总反应体系为100mL。40°C下置于10rpm恒温震荡仪中反应，间隔2 h测定最大吸收波长处吸光值的变化。脱色率= (1-AAtl) *100%，Atl为脱色反应前溶液吸光值，A为脱色反应后溶液吸光值，所有脱色反应均重复3次取平均，计算脱色率达62.23%。而在没有TEMPO的参与下，仅加入同等酶活力的游离漆酶，脱色率仅有4.82%。
[0038]实施例5
将实施例1参与脱色反应后的共固定化漆酶与介体的磁性纳米粒子进行回收，采用磁铁的吸附分离共固定化磁性纳米粒子，然后用50 mM pH4.5的乙酸-乙酸钠缓冲冲洗4_5遍，重复使用回收的共固定化磁性纳米粒子，通过10次的连续降解脱色反应，结果见图1，从图1中可以看出经7次回收，共固定化磁性纳米颗粒仍然保持良好的稳定性，脱色率在50.55% 以上。
【主权项】
1.一种氨基硅烷化磁性纳米粒子共固定化漆酶和介体系统，其特征在于:该系统是将漆酶和介体共同固定化在氨基硅烷化磁性纳米粒子上，每Ig共固定化漆酶和介体系统中固定有0.2-0.5 mmol介体，固定化后的漆酶酶活为80_200U/g。2.权利要求1所述氨基硅烷化磁性纳米粒子共固定化漆酶和介体系统的制备方法，其特征在于包括如下步骤: 1)Fe3O4磁性纳米粒子的制备:将FeCl 2和FeCl 3混合，在N2保护、搅拌、70° C水浴的条件下，加入NaOH溶液，并持续搅拌1-2 h后，将黑色产物分离出来，去离子水洗至中性，得到Fe3O4磁性纳米粒子，然后将Fe3O4磁性纳米粒子置于7 (wt)%的四甲基氢氧化铵水溶液中静置2 h，用水洗涤3-5次备用； 2)Fe3O4磁性纳米粒子表面修饰APTES:将步骤I)制备得到的Fe 304磁性纳米粒子置于乙醇水溶液中，然后加入APTES，500C，搅拌反应10h，反应产物用去离子水清洗3-5次后，真空干燥，得到表面氨基硅烷化磁性纳米粒子； 3)介体的固定化:取步骤2)得到的氨基硅烷化磁性纳米粒子置于戊二醛溶液中静置2h，去离子水洗数次以除去多余的戊二醛，加入4-NH2-TEMP0，室温下震荡反应4h，反应结束后，分离出产物，水洗，得到接枝了介体的纳米粒子； 4)漆酶的固定:将漆酶加入乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，再加入接枝了介体的纳米粒子，35°C震荡反应4h后，再以乙酸-乙酸钠缓冲溶液清洗数次，以洗去未固定的酶，得到氨基硅烷化磁性纳米粒子共固定化漆酶和介体系统。3.根据权利要求2所述氨基硅烷化磁性纳米粒子共固定化漆酶和介体系统的制备方法，其特征在于:步骤O中FeCl2^P FeCl 3的摩尔比为1:2_2: 3。4.根据权利要求2所述氨基硅烷化磁性纳米粒子共固定化漆酶和介体的制备方法，其特征在于:步骤I)中NaOH溶液浓度为3 mol/Lo5.根据权利要求2所述氨基硅烷化磁性纳米粒子共固定化漆酶和介体的制备方法，其特征在于:步骤2)中每I g制备得到的Fe3O4磁性纳米粒子置于100-200 mL乙醇水溶液中，然后加入1-3 mL APTESo6.根据权利要求2所述氨基硅烷化磁性纳米粒子共固定化漆酶和介体的制备方法，其特征在于:步骤2)中乙醇水溶液中乙醇与水的体积比为1:1。7.根据权利要求2所述氨基硅烷化磁性纳米粒子共固定化漆酶和介体的制备方法，其特征在于:步骤3)中戊二醛溶液的质量浓度为2%。8.根据权利要求2所述氨基硅烷化磁性纳米粒子共固定化漆酶和介体的制备方法，其特征在于:步骤3)中每Ig氨基娃烧化磁性纳米粒子加入1-3 mmol的4_ΝΗ2_ΤΕΜΡ0。9.根据权利要求2所述氨基硅烷化磁性纳米粒子共固定化漆酶和介体的制备方法，其特征在于:步骤4)中Ig接枝了介体的纳米粒子与200 U的漆酶进行交联固定。10.根据权利要求2所述氨基硅烷化磁性纳米粒子共固定化漆酶和介体的制备方法，其特征在于:步骤4)中乙酸-乙酸钠缓冲溶液的浓度为50 mM，pH为4.5。
【专利摘要】本发明公开了一种氨基硅烷化磁性纳米粒子共固定化漆酶和介体系统及其制备方法，该系统是将漆酶和介体共同固定化在氨基硅烷化磁性纳米粒子上。在Fe2+和Fe3+溶液中加入NaOH溶液进行共沉淀反应制得Fe3O4纳米粒子；采用3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）对其进行修饰获得表面氨基化的磁性纳米粒子；以戊二醛作为交联剂，将磁性纳米粒子表面的部分氨基接枝4-NH2-TEMPO，得到接枝了介体TEMPO的纳米粒子；最后加入到漆酶溶液中，经戊二醛交联固定化漆酶得到。本发明首次将漆酶与介体共固定于磁性载体上，通过外部磁场可将酶与介体便捷的回收并重复使用，从而提高了酶的利用率，降低成本。
【IPC分类】C12N11/14
【公开号】CN104911175
【申请号】CN201510380214
【发明人】贾红华, 高振, 赵佳, 夏永洋, 韦萍, 周华
【申请人】南京工业大学
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年7月2日