0位于基因簇核苷酸序列第37189-36809位，编码未知功能蛋白，长度为127 个氨基酸；
[0069] txn22位于基因簇核苷酸序列第38570-39670位，编码未知功能蛋白，长度为367 个氨基酸；
[0070] txn48位于基因簇核苷酸序列第66666-65500位，编码未知功能蛋白，长度为389 个氨基酸。
[0071] txn54位于基因簇核苷酸序列第73004-73552位，编码未知功能蛋白，长度为183 个氨基酸。
[0072] 在另一优选例中，所述的三欣卡辛生物合成基因簇的序列如SEQ ID NO. :1中第 1-102575 位或第 5384 - 80087 位所示。
[0073] 本发明的第二方面，提供了一种三欣卡辛的生物合成相关蛋白，所述的蛋白氨基 酸序列选自如SEQ ID NO. :2-57中任一所不的氨基酸序列。
[0074] 在另一优选例中，所述的蛋白是txnZ蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO. :Z + 1所 示，其中Z为0-55的整数。
[0075] 本发明的第三方面，三欣卡辛的生物合成相关基因，所述的合成相关基因编码本 发明第二方面所述的三欣卡辛的生物合成相关蛋白。
[0076] 本发明的第四方面，提供了一种如本发明第一方面所述的三欣卡辛生物合成基因 簇，或本发明第二方面所述的三欣卡辛生物合成相关蛋白或蛋白组合用于催化合成三欣卡 辛及类似物的用途。
[0077] 在另一优选例中，所述的蛋白组合是txnZ蛋白中2-55个蛋白所构成的组合，其中 Z为0-55的整数。
[0078] 本发明的第五方面，提供了 一种表达载体，所述表达载体含有如本发明第一方面 所述的三欣卡辛的生物合成基因簇或如本发明第三方面所述的三欣卡辛的生物合成相关 基因。
[0079] 本发明的第六方面，提供了一种重组的宿主细胞，所述宿主细胞含有如本发明第 五方面所述的表达载体，或其染色体上整合有外源的如本发明第一方面所述的三欣卡辛的 生物合成基因簇或本发明第三方面所述的三欣卡辛的生物合成相关基因。
[0080] 在另一优选例中，所述重组的宿主细胞包括链霉菌。
[0081] 本发明的第七方面，提供了一种产生三欣卡辛的方法，所述方法包括步骤：培养如 本发明第六方面所述的宿主细胞，从而表达三欣卡辛；以及
[0082] 分离出所述的三欣卡辛。
[0083] 在另一优选例中，所述的培养包括：用发酵培养基进行培养；优选地，所述的发酵 培养基包括以下组分：吸附性材料；较佳地，所述的吸附性材料是大孔树脂，更佳地，所述 的吸附性材料是大孔树脂HP20。
[0084] 在另一优选例中，所述的发酵培养基包括以下组分：可溶性淀粉、葡萄糖、酵 母提取物、大孔树脂HP20,和微量元素；其中，所述的微量元素选自下组：CuS04 · 5H20、 FeSO4 · 7H20、MnCl2 · 4H20、ZnSO4 · 7H20、CoCl2 · 7H20、MgSO4. 7H20、KH2P04、（NH4) 2S04、NaCl。
[0085] 在另一优选例中，所述的培养还包括：用种子培养基进行培养；优选地，所述的种 子培养基为TSB培养基。
[0086] 在另一优选例中，所述的培养时间为2-10天，较佳地为3-7天。
[0087] 本发明第八方面，提供了一种突变菌株，所述的突变菌株是以产生三欣卡辛的菌 株为原始菌株，通过将所述原始菌株中的三欣卡辛生物合成基因簇中一个或多个基因失活 而形成的突变菌株。
[0088] 在另一优选例中，所述的原始菌株包括链霉菌，更佳地包括链霉菌Streptomyces bottropensis D0-45。
[0089] 在另一优选例中，所述的原始菌株是导入三欣卡辛生物合成基因簇的完整序列， 从而表达三欣卡辛的菌株。
[0090] 在另一优选例中，所述的失活是通过以下方法实现：同源重组、定点突变、基因敲 除、或其组合。
[0091] 在另一优选例中，所述的被失活的基因是选自如权利要求1中所述的三欣卡辛生 物合成所涉及的56个基因中的至少一个基因。
[0092] 在另一优选例中，所述的被失活的基因选自下组：txn21、txn41、txn44、txn49、 txn4、txn52,或其组合。
[0093] 本发明的第九方面，提供了一种本发明第八方面所述的突变菌株用于制备三欣卡 辛类似物的用途。
[0094] 在另一优选例中，所述的三欣卡辛类似物选自下组：Txn_21、Txn-41，Txn-44、 Τχη-49、Τχη-4-1、Τχη-4-2、Τχη_52〇
[0095] 本发明的第十方面，提供了一种三欣卡辛类似物，所述的三欣卡辛类似物通过以 下方法制备：
[0096] (1)提供本发明第八方面所述的突变菌株；
[0097] (2)对步骤（1)所述的突变菌株进行培养，从而得到所述的三欣卡辛类似物。
[0098] 在另一优选例中，所述的培养包括：用发酵培养基进行培养；优选地，所述的发酵 培养基包括以下组分：吸附性材料；较佳地，所述的吸附性材料是大孔树脂，更佳地，所述 的吸附性材料是大孔树脂ΗΡ20。
[0099] 在另一优选例中，所述的发酵培养基包括以下组分：可溶性淀粉、葡萄糖、酵 母提取物、大孔树脂ΗΡ20,和微量元素；其中，所述的微量元素选自下组：CuS0 4 · 5Η20、 FeSO4 · 7H20、MnCl2 · 4H20、ZnSO4 · 7H20、CoCl2 · 7H20、MgSO4. 7H20、KH2P04、（NH4) 2S04、NaCl。
[0100] 在另一优选例中，所述的培养还包括：用种子培养基进行培养；优选地，所述的种 子培养基为TSB培养基。
[0101] 在另一优选例中，所述的培养时间为2-10天，较佳地为3-7天。
[0102] 在另一优选例中，所述的三欣卡辛类似物选自下组：Txn-21、Txn-41，Txn-44、 Τχπ-49λ Txn-4-K Τχπ-4-2λ Τχη-52 ；
[0104] 本发明的第十一方面，提供了一种提高三欣卡辛产量的方法，所述方法包括步 骤：
[0105] 在吸附性材料存在下，培养三欣卡辛的生产菌，从而产生三欣卡辛；以及
[0106] 从培养体系或培养物中分离所述的三欣卡辛；
[0107] 较佳地，所述的吸附性材料是大孔树脂，更佳地，所述的吸附性材料是大孔树脂 HP20。
[0108] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附图说明】
[0109] 图1三欣卡辛A (trioxacarcin A)及其三欣卡辛B (trioxacarcin B)的化学结构 式。
[0110] 图2A完整的三欣卡辛生物合成基因簇；图2B三欣卡辛生物合成基因簇的基因组 成。
[0111] 图3三欣卡辛A在链霉菌Streptomyces bottropensis D0-45中的生物合成途径。 CoA :辅酶A ;ACP :酰基载体蛋白；TxnZ (或txnZ，Z=0-55):合成三欣卡辛的基因。
[0112] 图4链霉菌Streptomyces bottropensis D0-45野生型菌株发酵产物的液相色 谱-质谱（LC-MS)分析。Txn-Α:化合物三欣卡辛A。
[0113] 图5三欣卡辛生物合成基因簇相关性的证实与基因簇边界确定。最终确定 orf〇-〇rf55共56个基因与三欣卡辛生物合成相关，其他的orf (-12)-〇rf (-1)及orf (56) 到orf (77)为边界外基因。
[0114] 图5-1中断KS (txn8)聚酮合酶后，三欣卡辛不再产生；
[0115] 图5-2边界外的AT (orf-3)(酰基转移酶敲除掉后不影响三欣卡辛的产生）；
[0116] 图 5-3 上游边界外 orf-1 (membrane protein)及下游最后一个基因 txn55 (SARP) 敲除后对比野生型发酵图；
[0117] 图5-4 :敲除下游边界外基因 orf58并不影响三欣卡辛的生物合成。
[0118] 图6改变配方后加入大孔树脂HP20提高三欣卡辛产生量。
[0119] 图7pcr_targeting介导的突变株黏粒的构建及突变株基因型验证和发酵检测示 意图。其中，图7a为pcr-targeting法构建突变株黏粒示意图，图7b为接合转移后基因型 验证（带有Am-marker)(以0rf55为例），图7c为带有Marker的基因型和同框缺失删除 Marker后的基因型PCR验证图（以orfl6为例），图7d为是突变株的发酵与野生型对比 HPLC图，以此检测是否有新化合物产生。M :DL5000的基因标准对照条带。
[0120] 图8三欣卡辛合成基因簇中部分基因的敲除实验结果。
[0121] 图9各种新化合物的分析数据图。
[0122] 图10Txn-49和野生型的生物活性实验对比图。
【具体实施方式】
[0123] 本发明人经过长期而深入的研究，以链霉菌来源的三欣卡辛为目标分子，从克隆 其在Streptomyces bottropensis D0-45中的生物合成基因簇出发，采用微生物学、分子生 物学、生物信息学、生物化学及有机化学相结合的方法研究其生物合成，通过对其生物合成 机制的研究揭示蒽环骨架结构及乙酰脱氧糖基独特化学结构形成的酶学机理，在此基础上 运用基因工程的原理，合理修饰三欣卡辛的生物合成途径，提高三欣卡辛的产量，并分离得 到可能具有更好活性的一些列新化合物。
[0124] 术语
[0125] 如本文所用，术语"三欣卡辛"或"trioxacarcin"可互换使用，均指化合物三欣卡 辛A或三欣卡辛B，其结构如说明书附图1中所示。
[0126] 以下结合图1-图9对本发明进一步详细说明。
[0127] 利用保守基因的同源序列克隆完整生物合成基因簇
[0128] 分析前人报道的三欣卡辛的分子结构式发现，其分子中具有一个蒽醌类骨架结构 (图1)，蒽醌类抗生素家族是聚酮类天然产物中非常有特色的一类，它们中的绝大多数是 由放线菌产生的，具有良好的抗肿瘤活性。从生物合成角度看，蒽环类抗生素是由Π 型PKS 体系催化形成的。在这一催化体系中，KSa，KSe与ACP是II型PKS的核心蛋白，它们通过 相互作用形成minimalPKS异源复合物。其中的KS a负责催化合成砌块之间的Claisen缩 合，从而将C链延长；而KSe控制着Claisen缩合发生的次数，从而决定最终形成的C链的 长度，因此又称为链延伸因子（CLF)。合成过程中的聚酮链结合在ACP上形成聚酮酰ACP。 合成结束后的聚酮链与KS a、KS β脱离，经环化、氧化、还原、甲基化以及其它一些后修饰 形成成熟的蒽环骨架结构。（图3)
[0129] 本发明人根据已经报道的蒽醌类抗生素 KSa和KSi3的氨基酸序列，分析它们 的保守序列，设计了简并引物（For(KS) :A TC ACC GTG GCC TGY TTY GAY GCSATC-3'， Rev(CLF) :CC GGT GTT GAC SGS RTA GAA CCA NGC ;S=C 或G, Y=C或T, R=A 或G)进行PCR，从 Streptomyces bottropensis D0-45 基因组 DNA 中扩增得到了 I. Ikb 的片段，克隆入 pGEM-T Easy载体。DNA序列分析表明插入片段与聚酮合酶（KS)同源性很高[IdentitieS=79%， Positives=85%],因此,该片段很可能与三欣卡辛的生物合成相关。
[0130] 将上述克隆得到的基因片段进行地高辛标记，用于文库筛选。对筛选到的正确黏 粒测序，利用已知序列信息进行染色体步移，直至得到的黏粒能够完整地覆盖整个基因簇。 使用基因簇序列同源性在线分析软件FramePlot4. Obeta(http://nocardia. nih. go. jp/ fp4/)，对所获得的102575bp核苷酸序列进行的分析发现了 75个orf和I个不完整的 orf (图2B)。目的蛋白氨基酸序列同源性分析是使用美国国家生物信息中心提供的Blast 搜索引擎（http://www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/)。序列中各个基因对应的核苷酸位置和 编码蛋白功能的生物信息学分析结果如表1所示（与三欣卡辛生物合成不相关的基因仅显 示了一部分）。以上实验内容表明，三欣卡辛的生物合成基因簇是通过同源序列克隆得到， 同时，三欣卡辛生物合成基因簇中的保守基因也可以用作同源探针或者其他形式的同源参 考序列来筛选与三欣卡辛类似的次级代谢产物的生物合成基因簇。
[0131] 表1 :全序列功能分析
[0132]
[0133]
[0134]
[0135] 其中，"位置"一栏的数字表示SEQ ID NO: 1中对应序列的核苷酸；数字从小到大， 表明该氨基酸序列是由SEQ ID NO: 1中对应序列的核