苷酸的正义链进行翻译得到；反之，表 明该氨基酸序列是由反义链翻译得到。
[0136] 三欣卡辛生物合成基因簇相关性和完整性的确定
[0137] 由于微生物次级代谢产物的生物合成基因在染色体上是连锁成簇存在的，本发明 人对已获得序列中的各个基因进行敲除实验，以验证所获得基因簇与三欣卡辛生物合成的 相关性及其完整性。
[0138] 基因敲除txn8完全中断了三欣卡辛的产生，证明筛选到的基因簇的确是与三欣 卡辛生物合成相关的；基因敲除〇rf(-3)、orf(-l)与orf(58)对三欣卡辛的产生没有影响， 证实得到的基因簇包含了三欣卡辛生物合成所需要的所有基因（图5)。在各个基因敲除突 变株中，有的完全中断了三欣卡辛的产生，有的产量有所变化，有的有新化合物出现（图8， 图9)。
[0139] 基于以上实验结果，并与同类化合物生物合成基因簇进行比较，本发明人确定三 欣卡辛的生物合成基因簇包含从txnO到txn55的56个开放读码框（图2B)，涵盖染色体 62. 819kb的区域。
[0140] 在整个基因簇中，13 个基因（txn5-8, txnl3, txnl7, 19, 27, 36, 39, 41，43, 46)用 于编码II型聚酮合成酶（PKS)及其相关蛋白；4个基因（txnl4-16, txnl2)编码起始单 元合成相关蛋白；13个基因（^111-4，^1128-32，^1142,45,49,50)编码糖基合成相关 蛋白；14 个后修饰基因，（txn21，23-26, txn35, 37, 38, 40, 44, 47, 51-53)编码氧化还原 酶，负责形成复杂的三并元含氧螺环；还包括2个抗性基因（txn33, 38)，7个调苄基因 (txn0，txn9-ll，txnl8,34,55)以及 3 个功能不确定的基因（txn20,22,48)。（表 1，图 2B)。
[0141] 三欣卡辛分子中蒽环骨架的合成
[0142] 负责合成三欣卡辛骨架的是II型PKS基因，包含三个重复利用的酶：KSa、KS e及 ACP，此三者相互作用形成复合体，构成miniPKS。聚酮链以特殊的七碳单元承载到KSIII上 转移到KS a上起始，并以丙二酰-CoA作为延伸单元进行8次延伸形成23C的聚酮酰-ACP。 接下来在芳香化酶和C-9位酮基还原酶的催化下形成第一个环；在二三环环化酶和单氧化 酶催化下形成第二、第三个环；最后发生脱羧及各种氧化还原酶对骨架的修饰后下形成成 熟的蒽环骨架（图3)。
[0143] 边链糖基单元的合成
[0144] 两个糖基单元的合成也是平行于蒽环骨架形成过程的。其合成过程起始于葡萄 糖-6-磷酸向dNDP-葡萄糖的转化（N为尿嘧啶或胸腺嘧啶），继而在dTDP-葡萄糖-4, 6-脱 水酶的作用下脱去一分子水，在2, 3-己糖脱水酶催化下又脱去一分子水，形成一个3, 4-二 酮基-2, 6-双脱氧的dNDP-己糖结构；在糖基-3-酮还原酶的催化下C-3位酮基被还原成羟 基并在3, 5-表异构酶的催化下发生异构化。此时得到的糖基化合物接下来分流以两种合 成路线分别得到1号和2号边链糖。1号边链糖是在两个酶作用下得到的，它们分别与丙酮 酸脱氢酶的a亚基和β亚基同源，txn3催化硫胺素焦磷酸与丙酮酸缩合生成2-a-羟乙 基硫胺素焦磷酸，再通过txn4的转乙醛作用将羟乙基转移到脱氧糖基的4'位羰基碳上，最 后通过异构化形成成熟的1号乙酰脱氧糖基单元。而2号边链糖则是在NDP-己糖-3-C-甲 基转移酶和己糖-4-酮基还原酶作用下形成2号糖基单元，成熟的糖基单元能够被糖基转 移酶识别，被转移到蒽环骨架上形成成熟的三欣卡辛分子（图3)。
[0145] 三欣卡辛或其类似物的制备
[0146] -直以来，获得结构稳定、活性更好、并能通过微生物大量发酵的新型三欣卡辛结 构类似化合物是我们研究该课题的重点目标之一，我们通过体内基因遗传操作，包括基因 缺失、中断、置换等实验手段最终获得三欣卡辛一系列的突变株，通过对其中一些的发酵分 析，发现已不再产生三欣卡辛及其类似物；其中一些则三欣卡辛的产量有所改变，还有一些 突变株，通过对其大量发酵分离纯化，获得了部分三欣卡辛的中间体化合物（图8,图9)。
[0147] 本发明中，制备三欣卡辛或其类似物的方法如下：
[0148] (1)提供一突变菌株；
[0149] (2)对步骤（1)所述的突变菌株进行培养，从而得到所述的三欣卡辛类似物。
[0150] 其中，所述的突变菌株是以产生三欣卡辛的菌株为原始菌株，通过将所述原始菌 株中的三欣卡辛生物合成基因簇中一个或多个基因失活而形成的突变菌株。
[0151] 在另一优选例中，所述的原始菌株包括链霉菌，更佳地包括链霉菌Streptomyces bottropensis D0-45。在另一优选例中，所述的原始菌株是导入三欣卡辛生物合成基因簇 的完整序列，从而表达三欣卡辛的菌株。优选地，所述的失活是通过以下方法实现：同源重 组、定点突变、基因敲除、或其组合。
[0152] 所述的被失活的基因是选自本发明所述的三欣卡辛生物合成所涉及的56个基因 中的至少一个基因。优选的所述的被失活的基因选自下组：txn21、txn41、txn44、txn49、 txn4、txn52,或其组合。
[0153] 在另一优选例中，所述的培养包括：用发酵培养基进行培养；优选地，所述的发酵 培养基包括以下组分：吸附性材料；较佳地，所述的吸附性材料是大孔树脂，更佳地，所述 的吸附性材料是大孔树脂HP20。
[0154] 在另一优选例中，所述的发酵培养基包括以下组分：可溶性淀粉、葡萄糖、酵 母提取物、大孔树脂HP20,和微量元素；其中，所述的微量元素选自下组：CuS0 4 · 5H20、 FeSO4 · 7H20、MnCl2 · 4H20、ZnSO4 · 7H20、CoCl2 · 7H20、MgSO4 · 7H20、KH2P04、（NH4) 2S04、NaCl。
[0155] 在另一优选例中，所述的培养还包括：用种子培养基进行培养；优选地，所述的种 子培养基为TSB培养基。
[0156] 在另一优选例中，所述的培养时间为2-10天，较佳地为3-7天。
[0157] 优选地，所述的三欣卡辛类似物选自下组：Txn-21、Txn-41，Txn-44、Txn-49、 Τχη_4_1> Τχη_4_2> Τχη_52〇
[0158] 文献中报道[The Jounal of Antibiotics. 1981，1520]的三欣卡辛的产量为 l-2mg/L，低的产量对研究其生物合成途径及获得活性中间体带来很大的困难。因此找到合 理的提高其产量的方法和途径是及其重要的。本发明人通过改变培养基配方和发酵时间， 获得每升的培养基可获得三欣卡辛A纯品近500mg，相对原来的产量而言提高了近400倍。 这也为接下来研究三欣卡辛的生物合成途径奠定了基础，同时所有的突变株也是在此培养 条件下发酵获得（图4,图5)。
[0159] 本发明的应用及优点
[0160] 三欣卡辛作为一种蒽醌类抗生素，其生物活性、作用机制和生物合成路线有其独 特的地方，这些机制的阐明对于发现新的药物作用靶点、作用机制有重要意义。在对其生物 合成机制有着充分理解的基础上，有助于通过对生物合成途径的合理化遗传修饰，来构建 三欣卡辛的高产菌株或获得更具应用价值的结构类似物。
[0161] 本发明以链霉菌来源的三欣卡辛为目标分子，从克隆生物合成基因簇出发，采用 微生物学、分子生物学、生物化学及有机化学相结合的方法验证其负责三欣卡辛的生物合 成。期望通过体内基因操作、体外异源表达等方法，研究三欣卡辛的生物合成机理，提高其 发酵产量。这有利于合理修饰三欣卡辛的生物合成途径，以便获得结构稳定、活性更好、并 能通过微生物大量发酵的新型三欣卡辛结构类似化合物。
[0162] 三欣卡辛生物合成基因簇的应用
[0163] 本发明的三欣卡辛生物合成基因簇的应用，包括（但并不限于）：
[0164] (1)可利用本发明提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列，通过聚合酶链式反应 (PCR)的方法或利用包含本发明序列的DNA作为探针进行Southern杂交从其它微生物中得 到三欣卡辛生物合成基因的同源基因；
[0165] (2)构建包含本发明所提供的基因簇核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的质粒， 以用于研究或生产目的；
[0166] (3)本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因，可以通过合 适的表达体系在外源宿主中表达以得到相应的酶或其它更高的生物活性或产量的酶。这些 外源宿主包括链霉菌、假单孢菌、大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母、植物和动物等；
[0167] (4)本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列的基因或基因簇可以通过遗传 重组来构建质粒以获得新型生物合成途径，也可以通过插入、置换、缺失或失活进而获得新 型生物合成途径；
[0168] (5)本发明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列可以被修饰或突变。这 些途径包括插入、置换或缺失，聚合酶链式反应，错误介导聚合酶链式反应，位点特异性突 变，不同序列的重新连接，序列的不同部分或与其他来源的同源序列进行定向进化（DNA shuffling),或通过紫外线或化学试剂诱变等；
[0169] (6)本发明所提供的具有三欣卡辛合成相关蛋白可用于抗体的制备；
[0170] (7)对于本发明所提供的氨基酸序列或部分序列，可对多肽进行改造，以便获得去 除或替代某些氨基酸之后仍有生物活性甚至有新的生物学活性，或提高产量或优化蛋白动 力学特征；
[0171] (8)本发明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列，可以用来调节三欣卡辛或其 衍生物的产量；
[0172] (9)本发明提供的核苷酸序列或多个序列可以与载体序列融合而得到重组序列和 相应的DNA分子；
[0173] (10)本发明提供的三欣卡辛产量提高的方法，可以用来获得更多的三欣卡辛及其 类似物；
[0174] (11)本发明提供的几种三欣卡辛中间体化合物，可以用来进一步研究其生物活 性，亦可以通过其他手段对分子进行修饰从而获得活性更理想的天然产物类似物。
[0175] 总之，本发明所提供的包含三欣卡辛生物合成相关的所有基因和蛋白信息有助于 阐明与理解三欣卡辛及相关抗生素家族生物合成的分子机理。本发明所提供的基因及其蛋 白质也可以用来寻找和发现可用于医药、工业或农业的化合物或基因、蛋白。
[0176] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如 Sambrook 等人，分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989 或 Hopwood 等人，1985 年，Genetic manipulation of Streptomyces:A Laboratory Manual, John I nnes Foundation, Norwich, UK)中所述的条件，或按照制造厂 商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计。
[0177] 实施例1
[0178] 三欣卡辛产生菌链霉菌Streptomyces bottropensis D0-45基因组DNA的提取：
[0179] 1)收集菌丝
[0180] 将 100 μ LI X IO8 个/mL 的 Streptomyces bottropensis D0-45 抱子悬液接种到 3mL TSB液体培养基中，30°C，230rpm培养约24hr后达到对数生长期后期，取2mL接种到 50mLTSB中（含25mM氯化镁），30°C，250rpm培养约36hr后达到稳定生长期前期，呈乳黄 色浑浊，将菌液4°C，3500rpm，离心15min收集菌丝，用溶菌缓冲液洗涤，收集淡黄色菌丝 0· 5mL〇
[0181] 2)抽提基因组DNA
[0182] 向ImL菌丝中加入IOmL溶菌缓冲液（含溶菌酶5mg/mL)，涡旋至均一，37°C水浴 15mim。加入0.1 mL蛋白酶K溶液（10mg/mL，用溶菌缓冲液新鲜配制），lmL10%SDS，混匀后 迅速放入70°C水浴15mim，呈澄清。置冰上冷却，加入2. 5mL5M KAc，冰上冷却15min。加入 IOmL饱和酚，混匀，IOmL氯仿，混匀，12000rpm，4°C离心20min。用破口的枪头将水相吸出置 于新的离心管，加等当量的氯仿：异戊醇（24:1)抽提，12000rpm，4°C离心10min。用破口的 枪头将水相吸出置于新的离心管，加2倍的无水乙醇，混匀，有大团的DNA出现。将其钩出置 于新的离心管，加5mL70%乙醇洗涤，将液体倾出，用枪吸净，加5mL TE缓冲液溶解，加 RNase A使终浓度为50 μ g/mL，37°C温育0. 5小时。依次用等体积的饱和酚抽提两次，氯仿：异戊 醇（24:1)抽提两次，向水相中加入0. 1体积的3M NaAc，2体积的无水乙醇，轻轻的混合充 分，有絮状DNA出现。将四管DNA合并到两管（每管中有lmL70%乙醇用于洗涤），将液体吸 出，再加 ImL无水乙醇洗涤，吸出乙醇，超净台中吹干，溶