对成熟胚培养不同时间后的形态图；
图2为本发明实施例的转化率结果图；
图3为本发明实施例1中第2组转化荧光效果图。
【具体实施方式】
[0023]下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述
【发明内容】
所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
[0024]实施例1
1)将结缕草种子在水中浸泡2天；置于含1%活性氯的次氯酸钠溶液中搅拌灭菌2小时，然后用无菌水反复清洗；
2)从成熟种子上切剥分离出胚，分为4组，并置于愈伤组织培养基中培养；其中第I组培养1-2天，至长出胚根；第2组培养3-4天，使得长出的胚根延长，胚芽出现，胚根胚芽基部稍微膨大，但尚未出现愈伤组织；第3组培养时间为5-6天，培养至胚根胚芽基部出现愈伤组织；第4组培养时间为7-8天，至愈伤组织稍微变大；
3)将步骤2)所得物置于渗透培养基中培养6-8小时。培养时，第I组和第2组将胚的切剥面贴附于培养基表面培养，第3组和第4组将愈伤组织部分贴附于培养基表面培养。将所述材料紧密排列，置于渗透培养基中央，形成直径约2-2.5cm的圆形。渗透培养基为愈伤组织培养基基础中添加0.3M山梨醇和0.3M甘露醇；
4)取等浓度转入质粒pUC19-#>和pAcHl-如?与金粒子混合。基因枪设备使用IDERAGIE-1II (Science TANAKA, Ishikari, Hokkaido, Japan)。转入参数:轰击距离为 5 cm，轰击气压为5 kg cm2，真空压为700 mm Hg。
[0025]5)将经基因枪转化后的所得植物组织置于渗透培养基继续培养24小时，再转移至愈伤组织继代培养基中培养；
6)转化后2天，对绿色蛋白荧光点进行计数。
[0026]转化率结果如附图2所示。
[0027]愈伤组织诱导培养基为:MS基础培养基添加30 g L1蔗糖，4 mg L 1 Thiamine-HCl(维生素 BI)，100 mg L1 a -ketoglutaric acid ( α -酬戊二酸)，5 mg L1 2，4_D(2，4-二氯苯氧乙酸)，0.2 mg L1 6-BA (6-苄氨基腺嘌呤)，pH值调整为5.8，用2g L 1植物凝胶固化。
[0028]渗透培养基为:愈伤诱导培养基中添加0.3M sorbitol (山梨糖醇)和0.3Mmannitol (甘露酉享)。
[0029]对比实施例1
除不进行第2)步骤和第3)步骤之外，其余与实施例1 一致。
【主权项】
1.一种高效对结缕草进行转基因的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤: 1)从结缕草成熟种子中切剥分离出成熟胚，置于愈伤诱导培养基中培养；培养至长出胚根、胚芽，或培养至在胚根胚芽基部出现愈伤组织； 2)将步骤I)诱导所得物于渗透培养基中预培养6-8小时； 3)利用基因枪转化法，将外源基因转入步骤2)所得物。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述愈伤诱导培养基的组分包括MS基础培养基中的成分和其它成分，所述其它成分包括30 g L1蔗糖、4 mg L 1维生素Bl、100 mgL 1 α -酮戊二酸、5 mg L 1 2，4_ 二氯苯氧乙酸、0.2 mg L-^-节氨基腺嘌呤；所述愈伤诱导培养基的PH值为5.8，用2g/L植物凝胶固化。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤I)的培养时间为1-8天，优选为1-4天。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述培养时间为1-2天，以胚根刚从胚中长出为准。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述培养时间为3-4天，以胚根继续生长，胚芽开始出现，胚根胚芽基部稍微膨大，但尚未出现愈伤组织为准。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述渗透培养基的组分包括MS基础培养基中的成分和其它成分，所述其它成分包括30 g L1鹿糖、4 mg L 1维生素Bl、100 mgL 1C1-酮戊二酸、5 mg L1 2，4-二氯苯氧乙酸、0.2 mg L 苄氨基腺嘌呤、0.3M山梨糖醇、0.3M甘露醇；所述渗透培养基的pH值为5.8，用2g L 1植物凝胶固化。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在步骤I)前对结缕草成熟种子进行预处理，和/或，在步骤3)之后将转化后的所得植物组织于渗透培养基中继续培养至少24小时后再转入愈伤组织继代培养基中培养； 所述预处理步骤包括: A)将种子在水中浸泡2天； B)置于含1%活性氯的次氯酸钠溶液中搅拌灭菌2小时，然后用无菌水反复清洗。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因枪转化法包括步骤: 1)将质粒与金粒子混合； 2)设置转入参数:轰击距离为5cm，轰击气压为5 kg cm 2，真空压为700 mm Hg。9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述外源基因的质粒载体包括PUC19和pAcHl中的至少一种。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述外援基因的质粒载体为pUC19-gfp和pAcHl-如?;所述pUC19-^.//洽有绿色荧光蛋白报告基因貧//基因；所述pAcHl-如洽有潮霉素抗性选择基因如?基因。
【专利摘要】本发明提供了一种高效对结缕草进行转基因的方法，该方法包括如下步骤：1）从结缕草成熟种子中切剥分离出胚，置于愈伤诱导培养基中培养短暂数日，至长出胚根、胚芽，或培养至在胚根胚芽基部出现愈伤组织；2）将步骤1）诱导所得物于渗透培养基中培养6-8小时，培养时，胚的切剥面贴附于培养基上；3）利用基因枪转化法，将外源基因转入步骤2）所得物。本发明转基因操作过程耗时短，省去胚性愈伤诱导过程，仅需不足10天；所得瞬时转化率最高可达62.95%；本发明无需复杂的操作，易于实施。
【IPC分类】A01H5/00, C12N15/82
【公开号】CN105002210
【申请号】CN201510543772
【发明人】王迅, 汪志辉, 张新全, 夏惠, 赖云松, 梁东, 林立金, 唐懿, 张贤聪, 代琳
【申请人】四川农业大学
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2015年8月31日