L，MgSO4 WH2O 0.6 g/ L，FeSO4 ? 7H20 0? 01 g/L，KH2PO4 0? 4 g/L，K2HPO4 0? 6 g/L，ZnSO4 0? 001 g/L ; 发酵条件：温度35°C，发酵时间18 h，起始pH6. 5,接种量10%，装液量50 ml/250ml ; (3) N-乙酰-D-氨基葡萄糖发酵液纯化 将由培养基离心获得的上清液，电渗析除盐，将除盐后发酵液真空加热，浓缩至过 饱和，对浓缩后的发酵液进行降温，并加入5倍无水乙醇，搅拌离心，得到高纯度N-乙 酰-D-氨基葡萄糖结晶。3. -种微生物发酵生产D-氨基葡萄糖的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的枯 草芽孢杆菌NJ090259菌株作为出发菌种，经种子培养和已优化的培养基发酵产生D-氨基 葡萄糖，包括以下步骤： (1)菌株筛选、鉴定与培养 采集50份土壤样品，稀释后涂布于初筛平板，采用初筛培养基：胶体几丁质2. 5 g/L， 磷酸氢二钾0.7 g/L，磷酸二氢钾0.3 g/L，硫酸镁0.5 g/L，硫酸亚铁0.01 g/L，琼脂20 g/ L，pH 7. 0,培养温度37°C，培养时间72h，进行培养，得到单菌落，分离菌落，得到枯草芽孢 杆菌，并对其进行摇瓶发酵培养，测定发酵液几丁质酶活力，并根据发酵液含几丁质酶活力 筛选菌株； (2 )发酵培养 将在平板培养基上活化后的枯草芽孢杆菌NJ090259接入种子培养基中，恒温摇床培 养，用作种子液，接入发酵培养基中，恒温摇床培养，离心取上清液，测定N-乙酰-D-氨基葡 萄糖含量； 平板培养基：胶体几丁质30 g/L，硫酸铵2 g/L，磷酸二氢钾1.0 g/L，硫酸镁0.5 g/L， 氯化钠 〇? 5 g/L，琼脂 20 g/L，pH 6. 5 ; 种子培养基：蛋白胨5. 0 g/L，牛肉膏5. 0 g/L，氯化钠5. 0 g/L，pH 7. 0-7. 2 ; 发酵培养基：胶体几丁质10 g/L，葡萄糖10 g/L，酵母膏3.0 g/L，MgSO4 WH2O 0.6 g/ L，FeSO4 ? 7H20 0? 01 g/L，KH2PO4 0? 4 g/L，K2HPO4 0? 6 g/L，ZnSO4 0? 001 g/L ; 发酵条件：温度35°C，发酵时间18 h，起始pH6. 5,接种量10%，装液量50 ml/250ml ; (3) N-乙酰-D-氨基葡萄糖发酵液纯化 将由培养基离心获得的上清液，电渗析除盐，将除盐后发酵液真空加热，浓缩至过 饱和，对浓缩后的发酵液进行降温，并加入5倍无水乙醇，搅拌离心，得到高纯度N-乙 酰-D-氨基葡萄糖结晶； (4) N-乙酰-D-氨基葡萄糖酸化水解 将N-乙酰-D-氨基葡萄糖结晶粗品配制成饱和溶液，加入37%浓盐酸至终浓度为 12-16%，90°C保温45-90min，冷却过夜，过滤得到的晶体用乙醇洗涤、真空干燥并检测，得到 高纯度D-氨基葡萄糖盐酸盐。4. 一种微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖和D-氨基葡萄糖的菌株，其特征在于， 已保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，一种地衣芽孢杆菌NJ091195菌株， 保藏号为CGMCC10258,保藏日期为2014年12月29日。5. -种微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖的方法，其特征在于，利用权利要求4 所述的地衣芽孢杆菌NJ091195菌株作为出发菌种，经种子培养和已优化的培养基发酵产 生N-乙酰-D-氨基葡萄糖，包括以下步骤： (1)菌株筛选、鉴定与培养 采集50份土壤样品，稀释后涂布于初筛平板，采用初筛培养基：胶体几丁质2. 5 g/L， 磷酸氢二钾0.7 g/L，磷酸二氢钾0.3 g/L，硫酸镁0.5 g/L，硫酸亚铁0.01 g/L，琼脂20 g/ L，pH 7. 0,培养温度37°C，培养时间72h，进行培养，得到单菌落，分离菌落，得到地衣芽孢 杆菌，并对其进行摇瓶发酵培养，测定发酵液几丁质酶活力，并根据发酵液含几丁质酶活力 筛选菌株； (2 )发酵培养 将在平板培养基上活化后的地衣芽孢杆菌NJ091195接入种子培养基中，恒温摇床培 养，用作种子液，接入发酵培养基中，恒温摇床培养，离心取上清液，测定N-乙酰-D-氨基葡 萄糖含量； 平板培养基：胶体几丁质30 g/L，硫酸铵2 g/L，磷酸二氢钾1.0 g/L，硫酸镁0.5 g/L， 氯化钠 〇? 5 g/L，琼脂 20 g/L，pH 6. 5 ; 种子培养基：蛋白胨5. 0 g/L，牛肉膏5. 0 g/L，氯化钠5. 0 g/L，pH 7. 0-7. 2 ; 发酵培养基：胶体几丁质10 g/L，葡萄糖10 g/L，酵母膏3.0 g/L，MgSO4 WH2O 0.6 g/ L, FeSO4 ? 7H20 0. 01 g/L, KH2PO4 0. 4 g/L, K2HPO4 0. 6 g/L, ZnSO4 0. 001 g/L ； 发酵条件：温度35°C，发酵时间18 h，起始pH6. 5,接种量10%，装液量50 ml/250ml ; (3) N-乙酰-D-氨基葡萄糖发酵液纯化 将由培养基离心获得的上清液，电渗析除盐，将除盐后发酵液真空加热，浓缩至过 饱和，对浓缩后的发酵液进行降温，并加入5倍无水乙醇，搅拌离心，得到高纯度N-乙 酰-D-氨基葡萄糖结晶。6. -种微生物发酵生产D-氨基葡萄糖的方法，其特征在于，利用权利要求4所述的 地衣芽孢杆菌NJ091195菌株作为出发菌种，经种子培养和已优化的培养基发酵产生N-乙 酰-D-氨基葡萄糖，包括以下步骤： (1)菌株筛选、鉴定与培养 采集50份土壤样品，稀释后涂布于初筛平板，采用初筛培养基：胶体几丁质2. 5 g/L， 磷酸氢二钾0.7 g/L，磷酸二氢钾0.3 g/L，硫酸镁0.5 g/L，硫酸亚铁0.01 g/L，琼脂20 g/ L，pH 7. 0,培养温度37°C，培养时间72h，进行培养，得到单菌落，分离菌落，得到地衣芽孢 杆菌，并对其进行摇瓶发酵培养，测定发酵液几丁质酶活力，并根据发酵液含几丁质酶活力 筛选菌株； (2 )发酵培养 将在平板培养基上活化后的地衣芽孢杆菌NJ091195接入种子培养基中，恒温摇床培 养，用作种子液，接入发酵培养基中，恒温摇床培养，离心取上清液，测定N-乙酰-D-氨基葡 萄糖含量； 平板培养基：胶体几丁质30 g/L，硫酸铵2 g/L，磷酸二氢钾1.0 g/L，硫酸镁0.5 g/L， 氯化钠 〇? 5 g/L，琼脂 20 g/L，pH 6. 5 ; 种子培养基：蛋白胨5. 0 g/L，牛肉膏5. 0 g/L，氯化钠5. 0 g/L，pH 7. 0-7. 2 ; 发酵培养基：胶体几丁质10 g/L，葡萄糖10 g/L，酵母膏3.0 g/L，MgSO4 WH2O 0.6 g/ L，FeSO4 ? 7H20 0? 01 g/L，KH2PO4 0? 4 g/L，K2HPO4 0? 6 g/L，ZnSO4 0? 001 g/L ; 发酵条件：温度35°C，发酵时间18 h，起始pH6. 5,接种量10%，装液量50 ml/250ml ; (3) N-乙酰-D-氨基葡萄糖发酵液纯化 将由培养基离心获得的上清液，电渗析除盐，将除盐后发酵液真空加热，浓缩至过 饱和，对浓缩后的发酵液进行降温，并加入5倍无水乙醇，搅拌离心，得到高纯度N-乙 酰-D-氨基葡萄糖结晶； (4) N-乙酰-D-氨基葡萄糖酸化水解 将N-乙酰-D-氨基葡萄糖结晶粗品配制成饱和溶液，加入37%浓盐酸至终浓度为 12-16%，90°C保温45-90min，冷却过夜，过滤得到的晶体用乙醇洗涤、真空干燥并检测，得到 高纯度D-氨基葡萄糖盐酸盐。7. 根据权利要求2所述的微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖的方法，其特征在 于，所述培养基的碳源和氮源如下：所述碳源包括葡萄糖、黑曲霉菌渣、木霉菌渣、黑木耳生 产下脚料、香菇生产下脚料、果糖、蔗糖、半乳糖、糊精、甘油、淀粉、糖浆和糖蜜中的一种或 几种，所述氮源包括氨水、豆粉、麦芽、玉米浆、棉籽粉、酵母浸膏、氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、 醋酸铵、硝酸钠和尿素中的一种或几种。8. 根据权利要求3所述的微生物发酵生产D-氨基葡萄糖的方法，其特征在于，所述培 养基的碳源和氮源如下：所述碳源包括葡萄糖、黑曲霉菌渣、木霉菌渣、黑木耳生产下脚料、 香菇生产下脚料、果糖、蔗糖、半乳糖、糊精、甘油、淀粉、糖浆和糖蜜中的一种或几种，所述 氮源包括氨水、豆粉、麦芽、玉米浆、棉籽粉、酵母浸膏、氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、醋酸铵、硝 酸钠和尿素中的一种或几种。9. 根据权利要求5所述的微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖的方法，其特征在 于，所述培养基的碳源和氮源如下：所述碳源包括葡萄糖、黑曲霉菌渣、木霉菌渣、黑木耳生 产下脚料、香菇生产下脚料、果糖、蔗糖、半乳糖、糊精、甘油、淀粉、糖浆和糖蜜中的一种或 几种，所述氮源包括氨水、豆粉、麦芽、玉米浆、棉籽粉、酵母浸膏、氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、 醋酸铵、硝酸钠和尿素中的一种或几种。10.根据权利要求6所述的微生物发酵生产D-氨基葡萄糖的方法，其特征在于，所述 培养基的碳源和氮源如下：所述碳源包括葡萄糖、黑曲霉菌渣、木霉菌渣、黑木耳生产下脚 料、香菇生产下脚料、果糖、蔗糖、半乳糖、糊精、甘油、淀粉、糖浆和糖蜜中的一种或几种，所 述氮源包括氨水、豆粉、麦芽、玉米浆、棉籽粉、酵母浸膏、氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、醋酸铵、 硝酸钠和尿素中的一种或几种。
【专利摘要】本发明涉及一种微生物发酵生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖和D-氨基葡萄糖的非遗传重组菌株，已保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，一种枯草芽孢杆菌NJ090259菌株，保藏号为CGMCC10257，以及一种地衣芽孢杆菌NJ091195菌株，保藏号为CGMCC10258，保藏日期均为2014年12月29日。本发明的有益效果为：提供了一种生产N-乙酰-D-氨基葡萄糖和D-氨基葡萄糖的新型菌株及其生产方法，利用该方法能够实现N-乙酰-D-氨基葡萄糖的稳定生产与供应，并且能够实现非动物源性的、安全的N-乙酰-D-氨基葡萄糖和D-氨基葡萄糖的生产，其生产周期短、成本低、更加环保。CGMCC NO.1025720141229
【IPC分类】C12R1/125, C12N1/20, C12R1/10, C12P19/26
【公开号】CN105039193
【申请号】CN201510040300
【发明人】邹季虹
【申请人】安徽正方生物科技有限公司
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年1月27日