酶切电泳图（M 为 DL5000marker);
[0085] 图21大肠杆菌总核酸电泳图；
[0086] 图22喂食表达dsRNA的菌液对亚洲玉米螟幼虫的基因沉默效果。
【具体实施方式】
[0087] 1、亚洲玉米螟丝素轻链基因的克隆
[0088] 本发明通过同源序列比对，根据已在NCBI登记过的近缘昆虫种的丝素轻链基因 的保守序列进行引物设计，并用设计的引物对含有目的基因的cDNA文库进行PCR扩增，再 对PCR产物进行克隆测序，最后结合RACE法获得基因的3'端及5'端序列，进而拼接分析 获得亚洲玉米螟丝素轻链基因的全长。
[0089] 1. 1 总 RNA 提取
[0090] 亚洲玉米螟幼虫总RNA的提取参照Promega公司的SV Total Isolation System 试剂盒，具体步骤如下：
[0091] 1)在一个RNase-free的离心管中加入250 u L的的RNA Lysis Buffer (BME已 加）；
[0092] 2)取健康的亚洲玉米螟5龄幼虫放入研钵中，迅速利用液氮将其研磨成粉，待液 氮挥发以后迅速将粉末转移入之前装有250 y L的裂解液的离心管中；
[0093] 3)再向离心管中加350 y L的的RNA Dilution Buffer (蓝色），颠倒3 - 4次混 合。70°C水浴 3min ;4) 12000rpm 离心 10 分钟；
[0094] 5)用移液枪将离心好的澄清裂解液移到新的无酶离心管中，避免吸到沉淀；
[0095] 6)向澄清裂解液中加入200 y L 95%乙醇，用移液枪吸放3-4次以混合。将此混 合液转移到离心柱装配体中。
[0096] 7) 12000rpm 离心 1 分钟；
[0097] 8)在无菌离心管中按顺序混合 40 u L Yellow Core Buffer，5 u L 0? 09M MnC12， 5iiL DNase I，像前次一样清空收集管，然后再装配体中加入50 iiL配好的孵育液；
[0098] 9)于20 -25°C孵育15分钟。然后，向离心柱中加入200 yL DNase Stop Solution， 12000rpm离心1分钟；
[0099] 10)加入 600 u L RNA Wash Solution，12000rpm 离心 1 分钟；
[0100] 11)清空收集管，向离心柱内加入250 yL RNA Wash Solution于离心柱装配 体?12000rpm离心2分钟；
[0101] 12)将离心柱转移到新的1. 5mL带盖洗脱管，向膜上加上100 ii L无核酸酶水洗一 次。12000rpm离心1分钟；
[0102] 13)洗脱下来的RNA使用Eppendorf蛋白质核酸分析仪检测，检测合格的样品 在-70 °C低温下保存，备用。
[0103] 1. 2cDNA第一条链的合成
[0104] 1)先在微型塑料离心管Microtube中按照以下比例配制10 y L的反应体系：
[0105]
[0106] 2) 65°C保温5min后置于冰上急冷（提高反转录的效率）；
[0107] 3)在上述反应液的体系中继续按以下比例配制反应体系：
[0108]
[0109]
[0110] 4)缓慢混匀，按照下面的条件进行反转录反应：
[0111] 42 °C 60min ；70°C 15min
[0112] 5)反应结束，将样品在冰上迅速冷却。
[0113] 1. 3亚洲玉米螟丝素轻链基因中间片段扩增
[0114] 1. 3. 1引物设计与合成
[0115] 找出NCBI上已经登录的鳞翅目其他昆虫的丝素轻链基因氨基酸的保守区 域进行引物设计，设计了如下一对引物，Fib-F :5' -ATGCTGCCCTTCGTTTTG-3'；Fib-R : 5' -CCCAAGCTGCTTCGAATT-3'，用于扩增亚洲玉米螟丝素轻链基因的核心区域。引物由上海 生物工程公司合成。
[0116] 1. 3. 2丝素轻链基因中间片段的扩增
[0117] 丝素轻链基因中间片段扩增的反应体系如下：
[0118]
[0119] 将反应液混合均匀，进行PCR扩增，扩增条件如下：
[0120] 94°C预变性5min ;94°C变性30sec，55°C退火30sec，72°C延伸2min，设定30个循 环；最后72°C延伸lOmin。
[0121 ] 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
[0122] 1. 3. 3目的基因片段产物的回收与纯化
[0123]米用 TaKaRa 公司的 Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit Ver. 2. 0 试剂盒， 用于凝胶回收：1)PCR的产物进行凝胶电泳以后，在紫外灯下将目的片段产物切出，放入 1.5mL无菌的离心管；2)向装有胶块的微型塑料离心管中加入600 yL的GM Buffer，使胶块 充分溶解；3)待胶块完全溶解后观察液体的颜色，如果颜色有黄变橙或粉，需要向该胶夜 加入10 yL的3M醋酸钠（pH5. 2)，均匀混合。4)将试剂盒中的核酸纯化柱（Spin Column) 安置于Col lection Tube上；5)将充分溶解后的胶夜转移入核酸纯化柱（Spin Column)中， 12000rpm离心1分钟，弃虑液；6)将700 y L的Buffer WB加入核酸纯化柱（Spin Column) 中，室温下12000rpm离心30s，弃滤液；7)重复步骤6 ;8)将Spin Column安置于新的1. 5mL 无菌离心管，在核酸纯化柱（Spin Column)内膜上加30 yL的灭菌蒸馏水（加热到60°C有 利于洗脱），室温静置lmin ;9)室温下12000rpm离心1分钟，洗脱DNA。
[0124] 1. 3. 4目的基因产物的连接与转化
[0125] 在微型塑料离心管中配制如下连接反应体系：
[0126] 回收产物 4.5UL
[0127] pMD_18T(18T 载体） 0? 5 y L
[0128] Solution I(含T4DNA连接酶的酶溶液）5.0yL
[0129] 将上述反应体系混匀后置于16°C金属浴，过夜连接；
[0130] 1)取连接液10 1^，0耶€[50^，共同置于1.51^的灭菌离心管中，混匀后，冰上静 置 30min;
[0131] 2)42°(：水浴458，迅速置于冰上2!^11;
[0132] 3)在无菌台上向上述1.5mL的离心管中加入800 yL的LB液体培养基，37°C震荡 60min ；
[0133] 4)吸取200 y L的菌液，均匀的涂在具有AMP抗性的平板上；
[0134]5)在酒精灯附近灭菌封口，置于37°C培养箱中过夜培养；
[0135] 6)次日观察。
[0136] 1. 3. 5单菌落PCR检测
[0137] 1)在无菌工作台上用无菌的枪头挑菌，加入到10mL的指形管（已加3 yL的氨苄、 3mL的LB液体培养基），在37°C下摇床过夜培养；
[0138] 2)按照下列反应体系进行PCR反应：
[0139]
[0140]
[0141] 将反应液混合均匀，进行PCR扩增，扩增条件如下：
[0142] 94°C预变性 5min ;94°C变性 30sec，55°C退火 30sec，72°C延伸 2min，设定 30 个循 环；最后72°C延伸lOmin。
[0143] 3)将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
[0144] 通过在保守区域设计的引物，以健康的亚洲玉米螟5龄幼虫提取的总RNA反转录 的cDNA为模版，可以扩增出一条长约530bp的特异条带，图1显示的PCR结果，与预期结果 一致。图2、图3分别显示胶回收与菌液PCR结果。测序结果显示该目的片段长526bp，经 过NCBI数据库的BLAST检索，该片段与其他昆虫的丝素轻链基因具有较高的同源性，由此 推断该片段为亚洲玉米螟丝素轻链基因的部分片段。
[0145] 1. 4丝素轻链基因的3' Race
[0146] 1. 4. 1反应原理与引物设计
[0147] 1) 3'端的获得是通过TAKARA的3' -Full RACE试剂盒所获得。
[0148] 2) 3'race引物设计与合成：
[0149] 根据之前已测序的中间片段设计了 4条3'端特异性引物，分别为3g: 5,-TCGCTCCAGTTGCTGACAATG-3, 、3b :5,-GCGACACCAACATCTACATCCT-3' 和 3c : 5' -ATCATCAACGACCTGTCCAACC-3'、3e :5' -GTTCAGGCAACAACTCTGGTCTC-3'，用于扩增亚洲玉 米螟丝素轻链基因的3'端序列。引物由上海生物工程公司合成。
[0150] 1. 4. 2 3'RACE 的扩增
[0151] 1)以第一步提取的亚洲玉米螟总RNA为模版，再通过试剂盒内的3'RACE Adaptor 引物进行反转录，由此获得1st Strand cDNA。反应体系如下：
[0152]
[0153]
[0154]反应条件：42°C，60min ;7(TC，15min
[0155] 2)使用3'RACE设计的特异性outer引物与试剂盒内的3'RACE outer Primer进 行outer PCR反应，体系如下：
[0156]
[0157] 混匀后，放入PCR仪扩增，条件如下：
[0158] 94°C预变性5min ;94°C变性30sec，55°C退火30sec，72°C延伸2min，设定30个循 环；最后72°C延伸lOmin。
[0159] 3)再以outer PCR反应体系为模版，分别使用3' RACE设计的特异性inner引物 与试剂盒内提供的3' RACE inner Primer进行inner反应，体系如下：
[0160]
[0161]
[0162] 混匀后，放入PCR仪扩增，条件如下：
[0163] 94°C预变性 5min ;94°C变性 30sec，55°C退火 30sec，72°C延伸 2min，设定 30 个循 环；最后72°C延伸lOmin。
[0164] 4)将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。扩增产物的胶回收、克隆测序。
[0165] 使用3' RACE端设计的2