。
[0049] 在另一优选例中，所述的佐剂包括氧化铝、皂苷、quilA、胞壁酰二肽、矿物油或 植物油、基于囊泡的佐剂、非离子嵌段共聚物或DEAE葡聚糖、细胞因子（包括IL-1、IL-2、 IFN-r、GM-CSF、IL-6、IL-12、和CpG)。
[0050] 本发明的第八方面，提供了如本发明第一方面所述的抗原表位肽或如本发明第二 方面所述的融合蛋白的用途，（a)用于制备针对PCSK9的抗体；和/或（b)用于制备治疗与 PCSK9相关的疾病的药物。
[0051] 在另一优选例中，所述的疾病包括：心血管疾病、高胆固醇血症、动脉粥样硬化、冠 心病等。
[0052] 本发明的第九方面，提供了一种制备本发明第二方面所述的融合蛋白的方法，包 括步骤：
[0053](i)在适宜条件下培养权利要求5所述的宿主细胞，从而表达权利要求2所述的融 合蛋白；
[0054] (ii)纯化所述融合蛋白。
[0055] 本发明的第十方面，提供了一种治疗方法，给需要的对象施用本发明第一方面所 述的抗原表位、第二方面所述的融合蛋白、第三方面所述的多核苷酸或者本发明第四方面 所述的表达载体或者本发明第五方面所述的宿主细胞或本发明第六方面所述的药物组合 物或本发明第七方面所述的的疫苗组合物。
[0056] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附图说明】
[0057] 图1显示了抗mPCSK9抗体ELISA检测结果。
[0058] 图2显示了抗人PCSK9抗体ELISA检测结果。
[0059] 图3显示了免疫后胆固醇浓度，PBS、DTT、mPCSK9对照组平均总胆固醇水平分别为 112. 4mg/dL、97. 2mg/dL和 110. 5mg/dL，疫苗免疫组PCSK9-l、PCSK9-6、PCSK9-7 免疫后总胆 固醇平均水平分别为87. 3mg/dL、82. 5mg/dL和89mg/dL。
[0060] 图4显示了免疫后高密度脂蛋白胆固醇浓度的检测结果。
【具体实施方式】
[0061] 本发明人通过广泛而深入的研究，获得一种PCSK9靶向的重组疫苗，实验结果表 明，所述重组疫苗能够有效的诱发动物机体产生针对PCSK9的免疫反应。本发明还提供了 基于PCSK9的抗原表位肽和融合蛋白。
[0062] 在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这 类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并 且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
[0063] 除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域 的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语 "约"意指该值可以从列举的值变动不多于1 %。例如，如本文所用，表述"约1〇〇"包括99 和101和之间的全部值（例如，99. 1、99. 2、99. 3、99. 4等）。
[0064] 虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法 和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
[0065] PCSK9
[0066]前蛋白转化酶枯草溶菌素 9(Proproteinconvertasesubtilisin/kexintype 9，PCSK9)是非常有医疗应用前景的调节血脂药物作用靶点。PCSK9前蛋白转化酶枯草杆菌 蛋白酶kexin9型，原名神经凋亡调控转化酶I(NeuralApoptosis-RegulatedConvertase 1，NARC-1)，是前蛋白转化酶枯草溶菌素家族的第9个成员。人类PCSK9基因位于1号染色 体长臂3区2带3亚带，大约有25378个碱基对组成，编码的PCSK9蛋白为一单链分子，由 692的氨基酸组成，分子量约为73kD从N末端到C末端分为以下4个部分：（1)信号序列， 由第1-30位氧基酸残基组成；(2)前结构域，由第31-152位氨基酸残基组成；(3)催化结构 域，由第153-451位氨基酸残基组成；（4)C-末端，由第452-692位氨基酸残基组成。
[0067] 在本发明的一个优选地实施方式中，hPCSK9(人PCSK9)氨基酸序列如下：
[0069] 其编码核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示。
[0070] 在本发明的一个优选地实施方式中，mPCSK9(鼠PCSK9)氨基酸序列如下：
[0072] 其编码核苷酸序列如SEQ ID NO. :3所示。
[0073] PCSK9主要在肝脏中表达；此外，小肠、肾脏、肺、脾、睾丸和胸腺中也有少量表达。 PCSK9以酶原的形式在内质网合成之后，通过自身催化，在蛋白链第152至153位氨基酸残 基之间切断裂解，使得前结构域与催化结构域分开，催化结构域成为分子量约为63kDa的 成熟蛋白；裂解之后的前结构域仍然与催化结构域通过共价作用相连以避免成熟的PCSK9 蛋白与底物接触激发酶活性，此后PCSK9还会经过一系列的转录后修饰，包括氨基酸残基 的糖基化，酸化以及酪氨酸硫化修饰。但是这些转录后的修饰对PCSK9功能的影响目前尚 不清楚。
[0074] PCSK9是近期发现的调节胆固醇代谢的重要蛋白，在胆固醇的代谢过程中发挥着 极其重要的作用，目前靶向PCSK9的抑制剂的研究发展迅速临床试验效果明显，对于使用 他汀类药物后胆固醇不能达标的病人使用PCSK9单抗能进一步降低胆固醇水平。
[0075] 本发明人首次使用疫苗的方法，以PCSK9为靶点，来达到降低胆固醇和预防动脉 粥样硬化的目的。
[0076] 抗原表位肽
[0077] 在本发明中，"抗原表位肽"、"抗原肽"可以互换使用，指源自PCSK9的，并且具有 与抗PCSK9抗体结合的活性的多肽的统称。
[0078] 在本发明中所述的抗原表位肽包括线性表位肽与构象表位肽。
[0079] 在本发明中优选的抗原线性表位肽长度<50个氨基酸（较佳地，<30个氨基酸； 更佳地，<15个氨基酸）。
[0080] 本发明提供了一种源自PCSK9的抗原线性表位肽，在本发明的一个优选地实施方 式中，所述抗原表位肽具有hPCSK9的第153-163位氨基酸，其氨基酸序列如下：
[0081] SIPffNLERITP(SEQ ID NO. :6),
[0082] 其编码核苷酸序列如SEQ ID NO. :5所示。
[0083] 在本发明中优选的抗原构象表位肽源自PCSK9,不仅包含了多个抗原表位，同时还 具备了源自PCSK9蛋白结构域的空间结构构象，实现了线性表位与构象表位协同增强的效 果。在本发明的另一优选地实施方式中，所述抗原表位肽为构象表位肽，具有mPCSK9的第 156-457位氨基酸，其氨基酸序列如下：
[0085] 其编码核苷酸序列如SEQIDNO. :7所示。
[0086] 在本发明的另一优选地实施方式中，所述抗原表位肽为构象表位肽，具有hPCSK9 的第153-454位氨基酸，其氨基酸序列如下：
[0088] 其编码核苷酸序列如SEQIDNO. : 9所示。
[0089] 应理解，所述术语还包括本发明抗原表位肽的衍生物，指本发明抗原表位肽在经 过1-3个氨基酸添加、1-2个氨基酸缺失并仍具有与抗PCSK9抗体结合活性的多肽。这些保 守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
[0090] 表 1
[0091]
[0092] 如本文所用，"分离的"是指物质从其原始环境中分离出来（如果是天然的物质，原 始环境即是天然环境）。如活体细胞内的天然状态下的多肽是没有分离纯化的，但同样的多 肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
[0093] 如本文所用，"分离的肽"是指本发明多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、 脂类、糖类或其它抗原性肽物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化本发 明多肽。基本上纯化的多肽（融合蛋白）在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。 本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。
[0094] -旦鉴定获得了相关的肽序列，就可以用重组法来大批量地获得相关肽序列。这 通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到 相关肽（融合蛋白）。
[0095] 此外，还可用化学方法直接合成相关肽序列。
[0096] 载体蛋白
[0097] 如本文所用，术语"载体蛋白"指在本发明的重组蛋白中作为蛋白结构骨架的蛋 白。通常，所述的载体蛋白是免疫原性较强的蛋白，例如病原体蛋白，代表性的例子包括 (但并不限于）：病毒蛋白、细菌蛋白、衣原体蛋白、支原体蛋白等。
[0098] 如本文所用，术语"抗原表位（肽）"指拟诱导动物产生免疫反应的其它蛋白的一 段肽，该表位相对于载体蛋白而言的不是指载体蛋白本身能够引起免疫反应的肽段。通常， 抗原表位指免疫反应拟靶向的肽段，较佳地来源于哺乳动物（如人）蛋白的一段肽，而不是 来自所述载体蛋白。
[0099] 如本文所用，术语.pdb专指蛋白质三级结构数据文件，来自Protein Data Bank (www. pdb. org)；
[0100] 如本文所用，术语DTT指白喉毒素的跨膜结构域；
[0101]如本文所用，术语T细胞表位又称为T细胞抗原表位，是抗原分子经过抗原呈递细 胞中酶解加工产生的一段肽，能够由主要组织相容性复合体（MHC)分子结合，呈递在细胞 表面被T细胞受体（TCR)结合，激活T细胞，包括T辅助细胞表位等。
[0102]如本文所用，术语"低免疫原性蛋白"是指单独免疫动物不能引起足够的免疫反应 的蛋白。
[0103] 如本文所用，术语"分子表面氨基酸残基区"或"表面氨基酸残基区"是指位于蛋白 分子表面的氨基酸残基组成的区域，优选地，所述"分子表面氨基酸残基区"包括loop区、 beta-tum区、N末端或C末端。
[0104] 代表性的载体蛋白
[0105] 白喉毒素及其跨膜结构域
[0106] 白喉毒素（diphtheriatoxin，DT)是感染了beta菌体的白喉棒状杆菌 (Corynebacteriumdiphtheriae)产生的外毒素，存在于临床使用的百白破疫苗成份中。安 全性得到多年临床使用的验证，罕见严重不良反应，目前尚无由白喉成份引起过敏反应的 报道。
[0107]白喉毒素分子由535个氨基酸残基构成，空间上相对独立的催化结构域 (l-193AAs)、跨膜结构域（205-378AAs)和受体结合域（386-535AAs)组成；跨膜结构域和受 体结合域本身无毒性，其功能是通过细胞表面受体结合，将催化结构域转导进入细胞内。
[0108] 白喉毒素氨基酸序列（P00588,DTX_C0RBE)如下所示：
[0111] 白喉毒素分子中的存在5个T