一种mrrp蛋白、基因、载体、工程菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种蛋白类生物高分子MRRP及其应用。 (二）
【背景技术】
[0002] 近年来多种性能优异的生物来源多肽、长肽和蛋白质被研究人员所发现。硅沉积 肽、钙结合肽段、壳聚糖结合肽段、蜘蛛丝蛋白、蜘蛛丝粘蛋白、节肢动物弹性蛋白以及贝壳 粘附蛋白等大量性能优异的新型蛋白类材料受到材料学研究的重视。由于化学合成法的限 制，当前蛋白类生物材料研究，多采用先合成小肽，而后通过小肽多级自组装形成较大药物 负载复合体的研究思路。基因工程法是进行蛋白质外源表达的常用方法，其所产目标蛋白 为单一长度产物，不存在化学合成所带来的副产物，且产物长度可达到数千氨基酸残基，合 成能力远超化学合成，同时生产成本也远低于化学合成。因此采用基因工程法制备蛋白类 生物材料的最佳选择，当前相关研究还较少。
[0003] 本发明选取具有pH响应自组装性能的蜘蛛丝蛋白氮端序列（Nt)，蜘蛛丝蛋白碳 端序列（Ct)，蜘蛛丝蛋白中部重复序列（SSR)，具有高弹性能的果蝇弹性蛋白（Res)部分序 列和具有高粘附性能的贻贝黏附蛋白（Ma)部分序列为目标功能肽段，借助基因融合技术， 形成由贻贝粘附蛋白（Mal)、果蝇弹性蛋白（Resl)、蜘蛛丝蛋白氮端序列（Ntl)、蜘蛛丝蛋 白中段重复序列（SSR)、蜘蛛丝蛋白碳端序列（Ctl)、果蝇弹性蛋白（Res2)和贻贝粘附蛋白 (Ma2)等7个嵌段顺次连接构成的新型蛋白类生物高分子MRRP，其长度为905个氨基酸残 基。MRRP为人工将3个远源物种（蜘蛛、果蝇和贻贝）来源的功能肽段融合形成的全新生 物高分子。由于自然生殖隔离的存在，没有理论支持本发明MRRP蛋白可能存在于任何已知 生物体中的可能性。该7嵌段MRRP具有优异的粘附性能、弹性和pH响应自组装性能，可体 外形成形式多样的生物医用材料，在诸多生物医用领域，尤其是医学缝合和伤口外敷方面 具有突出的应用潜力，在生物医药领域具有广阔的应用前景。 (三）
【发明内容】
[0004] 本发明目的是提供一种性能优异的生物医用高分子，具体为蛋白类生物高分子 MRRP，以及在制备伤口愈合药物中的应用。
[0005] 本发明采用的技术方案是：
[0006] 本发明提供一种MRRP蛋白，所述MRRP蛋白为人工设计制备的跨物种融合蛋白，来 源物种为蜘蛛、果蝇和贻贝，具体本发明选取具有PH响应自组装性能的蜘蛛丝蛋白氮端序 列（Nt)，蜘蛛丝蛋白碳端序列（Ct)，蜘蛛丝蛋白中部重复序列（SSR)，具有高弹性能的果蝇 弹性蛋白（Res)部分序列和具有高粘附性能的贻贝黏附蛋白（Ma)部分序列为目标功能肽 段，借助基因融合技术，形成MRRP蛋白，所述MRRP蛋白是由贻贝粘附蛋白（Mal)、果蝇弹性 蛋白（Resl)、蜘蛛丝蛋白氮端序列（Ntl)、蜘蛛丝蛋白中段重复序列（SSR)、蜘蛛丝蛋白碳 端序列（Ctl)、果蝇弹性蛋白（Res2)和贻贝粘附蛋白（Ma2)共7个嵌段顺次连接构成，长度 为905个氨基酸残基，所述MRRP蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO. 1所示。
[0007] 本发明由于蜘蛛、果蝇和贻贝间存在自然条件下不可能逾越的生殖隔离，因此没 有理论依据支持可能存在天然的本发明所述融合蛋白MRRP。
[0008] 本发明还提供一种所述MRRP蛋白的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO. 2所示。所述MRRP蛋白的编码基因序列为非天然基因序列，是经过密码子改造并由 人工合成的全新基因序列。由于构成MRRP的7个天然肽段存在大量大肠杆菌稀有密码子， 且具有较高的甘氨酸和丙氨酸比例，不适合直接在大肠杆菌中表达。因此，本发明对MRRP 的基因密码子进行了优化，移除了所有稀有密码子，并对甘氨酸和丙氨酸密码子进行了均 衡分配，最后通过全基因合成法获得新型人造蛋白类高分子MRRP的基因。同样由于生殖隔 离的存在，没有理论依据支持可能存在天然的本发明所述编码MRRP的基因。
[0009] 本发明涉及一种由所述编码基因构建的重组载体，所述MRRP表达载体的构建方 法为：将SEQIDNO. 2所示核苷酸序列插入质粒PUC57的EcoRV位点，表达元件为Lac启 动子、Lac操纵子、Lac核糖体结合位点（RBS)和T7终止子，全表达框长度为3005bp，对应 的核苷酸序列为SEQIDNO. 3所示。
[0010] 本发明涉及一种由所述重组载体转化制备的重组基因工程菌，所述重组基因工程 菌的构建方法为：将SEQIDNO. 3所示核苷酸序列导入宿主菌内（优选大肠杆菌DH5a菌 株），经表达纯化，获得重组基因工程菌。
[0011] 本发明所述MRRP蛋白的制备方法为：将含MRRP蛋白编码基因的重组基因工程菌 接种至自诱导培养基，培养温度为16~40°C，培养时间为12~24h，将培养液离心，收集菌 体，并重悬于细胞破碎缓冲溶液（50mM磷酸二氢钠，IOOmM氯化钠，pH5. 5,溶剂为去离子水） 中，超声破碎（130W的功率，超声4s，停歇6s的工作方式，超声破碎30min)，然后再次离心， 收集上清液，最后将上清液过阳离子柱并以含终浓度300~1000 mM氯化钠和0. 5~3.OM尿 素的细胞破碎缓冲液进行梯度洗脱，经目标洗脱峰粘附试验收集MRRP洗出液，经透析（优 选排阻分子量为14kDa的透析袋）和冷冻干燥，获得MRRP蛋白；自诱导培养基配方为：酵母 抽提物2. 0~6.Og/L，胰蛋白胨5. 0~10.Og/L，酪蛋白胨5. 0~10.Og/L，葡萄糖0. 1~ 2. 0g/L，磷酸氢二钾4. 0~8. 0g/L，磷酸二氢钾3. 0~9. 0g/L，磷酸铵2. 0~5. 0g/L，硫酸 镁 0? 2 ~I. 5g/L，氯化I丐 2. 0 ~6. 0mg/L，氯化钴 0? 5 ~4. 0mg/L，氯化铜 0? 5 ~2. 0mg/L， 硫酸猛1. 0~8. 0mg/L，钼酸钠3. 0~7. 0mg/L，硼酸0? 1~0? 6mg/L，氯化铁L0~7.Omg/ L，氯化锌0? 5~2. 5mg/L，甘油L0~10. 0g/L，丝氨酸0? 5~2. 0g/L，甘氨酸2. 0~8.Og/ L，丙基硫代-P-D-半乳糖苷24-320mg/L，溶剂为去离子水，pH7.0。目标洗脱峰粘附试验 做法为：取洗脱峰流出液20yL与20yL浓度为1M，pH为7. 5的Tris溶液混合均匀，并滴 于载玻片表面，于25°C下密封保湿孵育12h，然后以蒸馏水冲洗5次，并以考马斯亮兰染液 进行染色，着染蓝色的洗脱峰样品即为MRRP目标洗脱峰。
[0012] 本发明还提供一种所述MRRP蛋白在制备伤口愈合药物中的应用，具体所述的伤 口愈合药物为：将MRRP蛋白溶于体积浓度1 %醋酸水溶液中，配成lOOmg/mL的蛋白溶液； 然后将蛋白溶液与500mM、pH7. 4磷酸盐缓冲溶液以体积比5~10:1混合均匀（优选9:1)， 获得蛋白凝胶，即为伤口愈合药物；将蛋白凝胶加入到伤口中，合并伤口 2~12h即可实现 伤口粘合。
[0013] 本发明所述MRRP蛋白具有光催化交联、高弹、pH响应自组装和高粘特性，在钌和 可见光催化下可形成分子内和分子间酪氨酸二聚体交联;MRRP交联体具有高弹性能，弹性 伸长可达到200%以上；MRRP在pH6. 7~8.O间能够发生自组装，自组装胶体包括网状胶 体、顺式二聚体和顺式有序多聚体。
[0014] 本发明所有的百分比含量，没有特备指明，都属于质量百分比含量。
[0015] 与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：
[0016] 本发明新型生物高分子（MRRP蛋白）集成了蜘蛛丝蛋白的自组装性能、果蝇弹性 蛋白高弹性能和贻贝粘附蛋白的高粘性能，综合性能优异，且长度均一，可完全生物降解， 微生物法制备产量高、不存在化工污染。MRRP具有高粘弹性，可以粘合伤口，实现伤口的无 线粘合。 (四）
【附图说明】
[0017] 图1生物高分子MRRP的结构示意图，Mal-贻贝粘附蛋白，Resl-果蝇弹性蛋白， Nt1-蜘蛛丝蛋白氮端序列，SSR-蜘蛛丝蛋白重复序列、Ct1-蜘蛛丝蛋白碳端序列、Res2-果 蝇弹性蛋白，Ma2_贻贝粘附蛋白。
[0018] 图2生物高分子MRRP组装交联结构示意图。
[0019] 图3为质粒PUC57图谱