21为STCH+/-与STCH+/+小鼠皮层脑区记忆相关蛋白的表达及定量。
[0055] 图22为STCH+/-与STCH+/+小鼠不同鼠龄皮层内抑郁相关蛋白表达情况。
[0056] 图23为不同年龄段两组小鼠的神经递质检测结果。
【具体实施方式】
[0057] 下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
[0058] 实施例1
[0059] STCH基因敲除动物模型的构建方法，STCH条件性基因剔除小鼠是通过基因打靶 的策略，在STCH基因外显子2两端插入方向相同的LoxP位点，当该小鼠在导入Cre重组酶 的情况下，Cre重组酶通过识别LoxP位点，切除LoxP位点间的序列，达到在特定细胞中条 件性剔除STCH基因的目的。包括以下步骤：
[0060] 1)在小鼠胚胎成纤维细胞滋养层上培养来源于129SV/J品系雄性小鼠的CJ7胚胎 干细胞，收集通过针对于STCH基因外显子2的打靶载体产生突变的STCH基因敲除的胚胎 干细胞，
[0061] 2)制备小鼠供体囊胚，
[0062] 3)将STCH基因敲除的胚胎干细胞注入所述的小鼠供体囊胚，
[0063] 4)将含有STCH敲除胚胎干细胞的囊胚形成的胚胎移植到小鼠的子宫，
[0064] 5)该胚胎在小鼠子宫内生长成小鼠，
[0065] 6)获得进入种系的嵌合体小鼠，
[0066] 7)得到进入种系的嵌合体小鼠与C57BL/6J小鼠回交后得到杂合子仔鼠。
[0067] 具体采用以下步骤：
[0068] 步骤1小鼠胚胎成纤维细胞滋养层的制备及培养
[0069] 滋养层细胞培养液成分：500mlDMEM，6mlL-Glutamine，6ml非必需氨基酸，6ml青 链霉素溶液.4ul0 -巯基乙醇，90ml胎牛血清。用一次性滤器过滤，4°C保存。
[0070] 细胞冻存液：30 %胎牛血清，63%DMEM，7 %DMS0,现用现配并且预冷。上述所有试 剂均购自小鼠原代胚胎成纤维细胞制备：引颈处死妊娠13. 5d的雌鼠（129)。75%酒精喷 湿消毒，在超净台打开腹腔，取出有胚胎的雌鼠子宫；在无菌PBS中分离胚胎，去除卵黄囊、 羊膜和胎盘；将胎鼠移入另一装有无菌PBS的培养皿中，去除内脏、头；在无菌PBS中洗净， 用无菌的眼科剪将胎鼠剪碎后移入15mL离心管中，加2mLPBS，lOOOrpm离心，2min，弃上 清。加入5mL0. 25%胰蛋白酶（美国GIBC0公司），37°C消化15min后，加入适量滋养层细 胞培养液终止反应，l〇〇〇rpm离心，2min，弃上清。加入适量培养液，吹打成细胞悬液，转移到 10cm培养皿中，37°C，5%C02培养。
[0071] -般在第3天细胞长满培养皿，经传4代后，此细胞即原代小鼠胚胎成纤维细胞 (mouseembryonicfibroblast,MEF)〇
[0072] 小鼠胚胎成纤维细胞滋养层的制备：将丝裂霉素C(Roche公司）按20mg/L的浓度 添加到培养的MEF细胞中，37°C继续培养2h，MEF细胞停止增殖，此时即可用作ES细胞培养 的滋养层。经丝裂霉素C处理得到的滋养层细胞也可冻存备用。
[0073] 步骤2胚胎干细胞（ES细胞）的培养
[0074] ￡3细胞培养液：01^11高糖培养基，添加15%胎牛血清，100011/1111的1正，21111的 L-谷氨酰胺，0.ImM非必需氨基酸，ImM丙酮酸钠，1000X 巯基乙醇。
[0075]ES细胞的复苏及传代培养：本领域技术人员都可以直接从南方模式基因中心获 得SCR012细胞株。购买网站http://www.biomodel,com.cn/。取出冻存的ES细胞，将其 迅速置于37°C水浴中，使细胞悬液尽快融化；将融化的细胞悬液吸到已预先加入5mLES细 胞培养液的无菌离心管中，吹打混匀，l〇〇〇rpm，2min，弃上清。加入ES细胞培养液，吹打成 细胞悬液，移入已预先铺好经实施例1得到滋养层细胞的100mm培养皿中，补加适量的培养 液至总体积约为10mL，将培养皿放入37°C，5%C02培养。ES细胞的传代，吸去原培养液，加 入10mLPBS洗涤2次。加入2mL0. 25%胰蛋白酶，37°C消化5min;加入5mLES细胞培养 液终止消化，用吸管轻轻吹打，移入无菌离心管中，l〇〇〇rpm，2min，弃上清。加入ES细胞培 养液，吹打成细胞悬液。按1:3比例移入已预先铺好滋养层细胞的10cm培养皿中，补加适 量的培养液至总体积约为l〇ml将培养皿放入37°C，5%C02培养，每天更换新鲜的ES细胞 培养液。
[0076] 囊胚注射：生长在滋养层上的ES细胞，从一个ES细胞，迅速生长为一个小集落， 在倒置显微镜下，ES细胞集落呈岛状或巢状，向四周生长，细胞集落与周围滋养层细胞存在 明显界限，集落内部细胞之间连接致密，相差显微镜下细胞表面有折光较强的脂状小滴，而 单个细胞体积较小，细胞核大。ES细胞生长迅速，且易分化，隔天培养后即进行囊胚注射。 Gene-Trap方法获得的是高通量基因突变ES细胞，故注射前一定要将待注射的突变ES细胞 再鉴定，首先通过PCR来确定所用的细胞株是否是STCH突变。
[0077]ES细胞阳性克隆PCR鉴定
[0078] 打靶（打靶载体用Notl线性化），共挑取抗性ES细胞克隆96个，分别用P1+P2， P3+P4进行PCR阳性克隆筛选，结果：双侧臂均发生正确同源的克隆（9，24, 26，33，36，50， 53,57,58,62,75,79,95)共 13 个ES细胞阳性克隆。
[0079] 步骤3供体囊胚的制备
[0080] 很多因素都可以影响囊胚的数量，如小鼠的品系、小鼠的健康状况、适应性、超排 卵和实验时所处的季节等等。本发明采用3-5周龄（12g-14g)，C57BL/6J的雌鼠。超排卵 供体小鼠的准备：
[0081] 挑选12-14g的C57BL/6J的不动情雌鼠，在第一天下午，腹腔注射5IU的孕马血清 (PMS)。距前次注射PMS的时间不超过48h，腹腔注射5IU的人绒膜促性腺激素（HCG)，并将 雌鼠转移至有种雄鼠的笼中交配。第四天9:00前检查有阴栓者为供体雌鼠，单笼放置，此 天记作0. 5天。同天下午再挑选26-33g左右的昆明白动情雌鼠与输精管结扎的雄鼠交配。 第五天9:00前检查有阴栓者为受体雌鼠，单笼放置。第七天，即在交配后的第四天，收集供 体雌鼠子宫中的囊胚。囊胚的收集和培养：引颈处死3. 5dpc的超排卵供体C57BL/6J雌鼠， 70%的酒精棉球消毒腹部，在腹中线处做一横向切口。剪开的皮肤拉向切口的上下两侧，提 起腹膜，将其剪开，充分暴露腹腔。将肠组织向上提到翻转的腹膜上，找到子宫，用剪刀将 左右两侧子宫在输卵管与子宫角的衔接剪下，然后小心剪下子宫的联体部分，置于无菌的 60_培养皿中。再用剪刀分别在子宫头与子宫尾剪去输卵管及子宫角部分，使得两根单独 的子宫通畅。用5ml的一次性注射器吸取足量的M2,套上5号针头，在体视解剖镜下插入子 宫腔，推动注射针栓，正反方向冲洗子宫腔，子宫在冲洗时会轻度膨胀，小鼠胚胎将迅速沉 至培养皿底部。取一个35mm的培养皿，滴上数滴Brinster'sBM0C-3培养液（Sigma)，每 滴约200ul，上面覆盖上矿物油（Sigma)。在体视解剖镜下用移卵管收集胚胎，并转移至石 蜡油密封的培养液滴中，置于37°C、5%C02培养箱中培养2小时。
[0082] 步骤4囊胚注射操作步骤
[0083] 将持卵管、注射针的针管和操作平皿充满石蜡油。用显微镜的微调将其调至相同 的聚焦平面。注射用的ES细胞应在数天前解冻，注射当天早晨换上新鲜的ES培养液，1-2 小时后胰酶处理，做成单细胞悬液保存在Brinster'sBM0C-3培养液中。从35mm培养皿中 挑选约10个形态饱满、边界清晰、囊胚腔较大的囊胚转移至安装好持卵管和注射针的注射 槽内，用移卵管吸取少量的ES细胞放入其中。在10倍镜下用注射针吸取10-15枚小而圆 的ES细胞。40倍镜下用持卵管吸附囊胚的一侧，将注射针调整至对准囊胚的中心并使他们 处于同一水平面。转动注射针的操纵杆，使注射针快速刺破囊胚的壁，进入囊胚腔，推动注 射栗使ES细胞（10-15个）顺序进入囊胚腔，小心拔出注射针。将注射过的囊胚放置在操 作视野的另一侧，继续下一个囊胚的注射。
[0084] 步骤4胚胎的子宫移植
[0085] 将移卵管接上口控管，在体视解剖镜下依次小心吸入培养液、气泡、培养液、气泡、 注射后的囊胚、气泡、少量培养液。麻醉受体雌鼠，用75%酒精消毒受体鼠背部，在右侧靠近 第一腰锥的部位做一个lcm的横向切口。向两侧拉展直至可透过腹膜看见右侧卵巢及其脂 肪垫。在腹膜上用尖镊撕一个3_的小口。左手夹住脂肪垫向外拉出，子宫随之可见。用 小号止血钳夹住少许脂肪垫稍作固定。左手持尖镊夹住在子宫和输卵管接口处附近2_远 的子宫壁，右手持一个4号注射器针头和移卵管。在解剖显微镜下，针头在紧挨尖镊处避开 血管扎一个小孔，将移卵管的前端小心插入小孔中。将实施例3得到的胚胎缓慢吹入子宫 中。子宫和肠系膜送回腹腔，如果移植手术成功，17天后可有幼鼠出生，
[0086] 其中获得进入种系的嵌合体与C57BL/6J交配，获得STCH杂合子。
[0087] 实施例2
[0088] 对实施例1制得的STCH+/-小鼠（即STCH基因杂合敲除小鼠）表型进行鉴定。 STCH+/-小鼠（即STCH基因杂合敲除小鼠），实施例1方法制得；STCH-/-小鼠（即STCH基 因纯合敲除小鼠），为胚胎致死型。STCH+/+小鼠：正常对照小鼠。
[0089] 1、PCR检测新生小鼠基因型（采用常规操作手段进行）
[0090] 引物序列，PAGE纯化（表1)。
[0091] 表1小鼠的STCH基因序列
[0092]
[0093] 电泳条带大小：STCH+/+ :904bp,STCH+/-: 1372bp,C