[00781
[0079]
[0080] 采用实施例1所述制备方法，反应在相同规模和条件下进行，不同的是将3,4-二 甲氧基苯丙酸替换为3,4-二径基苯丙酸（e)，并且3,4-二径基苯丙酸的酷氯化反应过程是 将3g3,4-二径基苯丙酸溶于15mlN，N-二甲基甲酯胺中，加入8g碳酸钟及6ml氯化节， 80°C反应36小时，过滤，乙酸乙醋萃取，饱和食盐水洗涂，无水硫酸钢干燥，过滤，旋干溶剂 得中间体e25.6g。将5.6g中间体e2溶于6ml氨氧化钢水溶液（浓度20% )中，加入6ml 的甲醇，90°C反应4小时，旋干溶剂，在冰浴下加入lOmi浓盐酸至强酸性，析出固体，过滤， 收集滤饼得中间体e34.Ig。将4.Ig中间体e3溶于20ml二氯甲烧中，加入0. 1mlN，N-二 甲基甲酯胺，再加入1. 5ml氯化亚讽，45°C反应5小时，旋干溶剂得中间体f。
[0081] 8. 2实验结果：最终得到多胺衍生物PAM03盐酸盐2. 08g，质谱：[M+田+m/z = 574 ; 碳谱（lOOMHz，020) : δ = 176. 9,176. 7,149. 8,149. 4,147. 5,147. 6,138. 6,138. 4,127. 9， 127. 8,121. 4,121. 2,119. 7,119. 8,58. 6,58. 4,50. 5,50. 4,48. 3,48. 2,43. 2,43. 1,38. 6， 38. 4, 36. 7, 36. 6, 32. 9, 32. 8, 31. 2, 31. 1卵m。
[0082] 多胺衍生物PAM03化学结构如图1所示，其中R为0H，叫~η4为3,η5为2。
[008引实施例9 :多胺衍生物ΡΑΜ04盐酸盐的制备
[0084] 9. 1实验方法：
[0085]
[0086] 采用实施例1所述制备方法，反应在相同规模和条件下进行，不同的是将丙締腊 替换为3-下締腊。
[0087] 9. 2实验结果：最终得到多胺衍生物PAM04盐酸盐2. 33g，质谱：[M+田+m/z = 658 ; 碳谱（lOOMHz，020) : δ = 176. 7,176. 4,149. 7,149. 6,147. 1，146. 9,132. 7,132. 5,112. 7， 112. 6,112. 5,112. 3,122. 2,122. 1,56. 6,56. 4,56. 2,56. 1,49. 3,49. 1,48. 8,48. 7,46. 4， 46. 2,41. 7,41. 5,33. 2,33. 1,31. 6,31. 4,27. 2,27. 1,26. 7,26. 5,25. 8,25. 7卵m。
[008引多胺衍生物PAM04化学结构如图1所示，其中R为0邸3,叫、Π2为4,η3、Π4为3,η5为2。
[008引实施例10 :多胺衍生物ΡΑΜ05盐酸盐的制备
[0090] 10. 1实验方法：
[0091]
[0092] 采用实施例1所述制备方法，反应在相同规模和条件下进行，不同的是将3,4-二 甲氧基苯丙酸替换为3,4-二甲氧基苯甲酸（e)。
[0093] 10. 2实验结果：最终得到多胺衍生物PAM05盐酸盐2. 03g，质谱：[M+田+m/z= 574 ;碳谱（lOOMHz，020) : δ = 172. 9,172. 7,146. 8,146. 7,144. 6,144. 4,130. 5,130. 4， 111. 5, 111. 4,110. 6,110. 4,104. 6,104. 5,54. 5,54. 4,54. 2,54. 1,51. 3,51. 2,52. 1,52. 0， 44. 3,44. 1，36. 4, 36. 3, 24. 8, 24. 6, 24. 1，24. 0卵m。
[0094] 多胺衍生物PAM05化学结构如图1所示，其中R为0邸3,Πι~η4为3,η5为0。
[0095] 实施例11:多胺衍生物ΡΑΜ06盐酸盐的制备
[009引 10. 1实验方法：
[0097]
[0098] 采用实施例1所述制备方法，反应在相同规模和条件下进行，不同的是将双（2-氯 基乙基）胺替换为亚氨基二乙腊（a)。
[0099] 10. 2实验结果：最终得到多胺衍生物PAM05盐酸盐2. 09g，质谱：[M+田+m/z= 602;碳谱（lOOMHz，020) :δ= 176. 7,176. 5,145. 8,145. 6,143. 6,143. 4,130. 8,130. 6， 116. 6,116. 4,107. 6,107. 4,105. 6,105. 5,55. 6,55. 4,55. 2,55. 1,50. 3,50. 2,44. 2,44. 1， 42. 3,42. 1,34. 4,34. 3,31. 2,31. 1,26. 8,26. 6,22. 8,22. 7卵m。
[0100] 多胺衍生物PAM06化学结构如图1所示，其中R为0邸3,叫、Π4为3,η2、叫为2,η5 为2。
[0101] 实施例12 :多胺衍生物ΡΑΜ01盐酸盐对LPS、CpGDNA、PGN、LTA、病毒RNAW及酵 母多糖刺激免疫细胞释放炎症介质的抑制作用
[010引 12. 1实验方法：取0. 1ml无热原水配制的LPS(1μg/ml)、CpGDNA(10μg/ml)、 PGN(10yg/ml)、LTA(10yg/ml)、病毒ssRNA(10yg/ml)、病毒dsRNA(10yg/ml)和酵母多 糖狂ymosan) (10μg/ml)溶液，分别与浓度为2、6和20μΜ的多胺衍生物PAMOl盐酸盐水 溶液等体积混合，无热原水为空白对照组，37Γ振荡混合解育60分钟。将体外培养的小 鼠巨隧细胞株RAW264. 7细胞转移至96孔板中，每孔细胞密度为IXl06/ml，培养基体积 200μ1。取20μ1上述混合解育液加入RAW264. 7细胞中，12小时后收集细胞培养上清。 ELISA法检测各组炎症介质TNF-a和IL-6的释放水平。ELISA检测步骤按照eBioscience 公司小鼠化ISA试剂盒操作说明进行，主要步骤为：RAW264. 7细胞上清加入预包被有捕获 抗体的化ISA96孔板中，室溫解育2小时，PBS洗涂5次。加入生物素标记的一抗，室溫解 育1小时，PBS洗涂5次。加入亲和素标记的辣根过氧化物酶，室溫解育30分钟，PBS洗涂 5次。加入显色液，37°C解育10分钟，加入终止液。酶标仪450nm波长测定光密度值。
[0103] 12. 2实验结果：LPS、CpG DNA、PGN、LTA、病毒RNA W及酵母多糖刺激RAW 264. 7 细胞可引发TNF-a和IL-6的明显升高。经多胺衍生物PAM01盐酸盐处理之后，TNF-a和 IL-6的释放显著降低（P<0. 05或0. 01)，并且呈现明显剂量效应关系。结果如图2所示， 其中，图2A是显示对LPS的括抗作用、图2B是显示对CpG DNA的括抗作用、图2C是显示对 PGN的括抗作用、图2D是显示对LTA的括抗作用、图沈是显示对病毒ssRNA的括抗作用、图 2F是显示对病毒dsRNA的括抗作用，图2G是显示对酵母多糖狂ymosan)的括抗作用。
[0104] 实施例13 :多胺衍生物PAM01盐酸盐对热灭活大肠埃希菌（革兰阳性菌）和热灭 活金黄色葡萄球菌（革兰阴性菌）刺激免疫细胞释放炎症介质的抑制作用。
[0105] 13. 1实验方法：挑取在LB平板上生长的大肠埃希菌巧C)或金黄色葡萄球菌 (SA)菌落，转入LB液体培养基中，37Γ增菌培养至对数生长期（10~12小时）。离屯、，去 除培养基，W无菌生理盐水重悬细菌沉淀。沸水浴中灭活30分钟，检测细菌菌液浓度，备 用。取0.1ml无热原水稀释配制的热灭活大肠埃希菌（IX10?即/ml)或金黄色葡萄球菌 巧X10?即/ml)菌液，分别与浓度为2、6和20μΜ的多胺衍生物PAM01盐酸盐水溶液等体 积混合，无热原水为空白对照组，37°C振荡混合解育60分钟。将体外培养的小鼠巨隧细胞 株RAW264. 7细胞转移至96孔板中，每孔细胞密度为IXl〇6/ml，培养基体积200μ1。取 20μ1上述混合解育液加入RAW264. 7细胞中