合后 加入到培养基中混匀；与细胞一起孵育6小时后加入含10%血清的培养基500微升，18小 时后检测荧光素酶表达量。荧光素酶表达量的检测方法参照出厂商（Promega公司）提供 的使用说明。Lipofectamine2000(Lipo2000)作为阳性对照。
[0075] 实验结果：如图8所示的高分子材料G5-GAH-X在稳转荧光素酶的HeLa细胞上转 染荧光素酶siRNA的转染效果图，表明G5-GAH31、G5-GAH40、G5-GAH60和G5-GAH76的用量 分别为2,4,6,8,10微克时可以有效地将siRNA输送到细胞进行表达，并且在siRNA用量很 少的情况下（0.05微克）就可以有效地将目的基因沉默，材料的基因沉默效果超过商业化 的转染试剂Lipo2K。
[0076] 实施例5 :高分子材料G5-GAH60和对照物G5-Arg64，G5-BA60，G5-AH60以及 Lip〇2K在稳转荧光素酶的HeLa细胞上的敲除荧光素酶的效率
[0077] 研究实施例1中的高分子材料G5-GAH60和对照物G5-Arg64,G5-BA60,G5-AH60以 及Lip〇2K在稳转荧光素酶的HeLa细胞上进行转染，通过检测荧光素酶的表达量来评估材 料的基因转染效率。具体实验方法：将HeLa细胞培养在24孔板中孵育24小时，将0. 05微 克siRNA-FAM与G5-GAH60,G5-Arg64,G5-BA60,G5-AH60以不同质量比混合后加入到培养 基中混匀；与细胞一起孵育6小时后加入含10%血清的培养基500微升，18小时后检测荧 光素酶表达量。荧光素酶表达量的检测方法参照出厂商（Promega公司）提供的使用说明。 以商业化的转染试剂Lipo2K作为对照物。
[0078] 实验结果：如图9所示的高分子材料G5-GAH60,G5-Arg64,G5-BA60,G5-AH60以 及Lip〇2K在稳转荧光素酶的HeLa细胞上转染荧光素酶siRNA的转染效果图，经过实验筛 选，当以对胍基苯甲酸为功能基团时，并且在siRNA用量很少的情况下（0.05微克）就可 以有效地将目的基因沉默。而不以苯甲酸为连接键的G5-Arg64,没有胍基只连接苯甲酸 的G5-BA60,和没有连接键的只有胍基的G5-AH60在相同条件下均没有基因沉默效果，并且 G5-GAH60的基因沉默效果超过商业化的转染试剂Lipo2K。
[0079] 实施例6:高分子材料G5-GAH-60在HeLa细胞上的敲除凋亡蛋白Bcl-2的效率
[0080] 研究实施例1中的高分子材料G5-GAH-60在HeLa细胞上进行转染，通过检测 Bcl-2的mRNA表达水平来评估材料的基因转染效率。具体实验方法：将HeLa细胞培养在24 孔板中孵育24小时，将0. 5微克siBcl-2或阴性对照siNC与G5-GAH-60以不同质量比混 合后加入到培养基中混匀；与细胞一起孵育6小时后加入含10%血清的培养基500微升， 42小时后用RT-PCR检测Bcl-2mRNA的表达水平。以Lipo2K作为阳性对照。
[0081] 高分子材料G5-GAH-60与其它转染载体对HeLa细胞的基因敲除实验，实验结果如 图5所示。图10表明在细胞转染条件下，G5-GAH-60的基因敲除效率远高于市场化的转染 试剂Lipo2K(Lip〇2000)以及第五代聚酰胺-胺树形高分子。并且高分子材料G5-GAH-60 与阴性对照siNC的复合物没有非特异的基因敲除，说明本发明高分子材料具有低毒性和 较高的靶向性的特点。
[0082]实施例7 :高分子材料G5-GAH60,G5-Arg64,G5-BA60,和G5-AH60在HeLa细胞上 的运输蛋白的效率。
[0083] 研究实施例1中的高分子材料G5-GAH76运输蛋白的效率，具体实验方法是：将 HeLa细胞培养在48孔板中孵育24小时，将2微克连接了绿色荧光分子标记的牛血清白蛋 白（FITC-BSA)和不同的质量的G5-GAH60,G5-Arg64,G5-BA60,G5-AH60混合后加入到培养 基中，混匀；与细胞一起孵育6小时后用流式细胞仪检测细胞对蛋白的摄入情况。
[0084] 高分子材料G5-GAH60运输蛋白的实验，实验结果如图11所示。图11表明在细胞 转染条件下，G5-GAH60具有很高的蛋白质转染效果，G5-GAH60的蛋白质转染效率显著高 于不以苯甲酸为连接键的G5-Arg64,没有胍基只连接苯甲酸的G5-BA60,和没有连接键的 只有胍基的G5-AH60,而商业化转染试剂Lipo2K不具备转染蛋白的能力。说明本发明高分 子材料能够有效地将蛋白运输到细胞内。
[0085] 以上实施例只是为了说明本发明技术构思及特点，让本领域普通技术人员能够了 解本
【发明内容】
并据以实施，并不能以此限制本发明保护范围。凡是根据本
【发明内容】
的实质 所作的等效变化和修饰，都应涵盖在本发明保护范围内。
【主权项】
1. 一种胍基取代的芳香化合物修饰的高分子材料，其特征在于，包括阳离子高分子骨 架和胍基取代的芳香化合物功能基团，所述胍基取代的芳香化合物功能基团与所述阳离子 高分子骨架表面共价连接；所述高分子材料的结构如式（1)所示：式⑴中， R为阳离子高分子骨架； Y为连接键； X为1-1024的整数。2. 如权利要求1所述的高分子材料，其特征在于，所述R选自如式（8)所示的聚酰 胺-胺树形高分子、如式（9)所示的聚丙烯亚胺树形高分子、如式（10)所示的聚赖氨酸树 形高分子、如式（11)所示的支化聚乙烯亚胺或如式（12)所示的线性聚乙烯亚胺：式（8)、式（9)、式（10)中： M是树形高分子的核心，包括氨、乙二胺、丁二胺、己二胺、辛二胺、癸二胺和1，12-十二 烷二胺； η是1-10的整数； m是2-4的整数； 式（11)、式（12)中： y和z是1-5117的整数。3. 如权利要求1所述的高分子材料，其特征在于，所述Y如式（13)、式（14)、式（15)、 式（16)、式（17)或式（18)所示：式（17)中： k为1-20的整数。4. 如权利要求1所述的高分子材料，其特征在于，所述高分子材料的结构如式（1)所 示；所述R为如式（8)所示的聚酰胺-胺树形高分子；所述Y为如式（13)所示的酰胺键； 所述X为1-1024的整数倍；式⑶： M是聚酰胺-胺树形高分子的核心，包括氨、乙二胺、丁二胺、己二胺、辛二胺、癸二胺和 1，12-十二烷二胺； η是1-10的整数； m是2_4的整数。5. -种胍基取代的芳香化合物修饰的高分子材料的制备方法，其特征在于，所述方法 包括：将胍基取代的芳香化合物和阳离子高分子溶解于有机溶剂中，加入催化剂和碱进行 反应，将胍基取代的芳香化合物共价连接到阳离子高分子表面，得到如式（1)所示的胍基 取代的芳香化合物修饰的高分子材料。6. 如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述催化剂选自：二环己基碳二亚胺， N-羟基琥珀酰亚胺；所述碱为三乙胺；所述有机溶剂选自：二甲基亚砜，N，N-二甲基甲酰 胺。7. 如权利要求1所述的胍基取代的芳香化合物修饰的高分子材料作为核酸或蛋白分 子的输送载体的应用。8. 如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述核酸是DNA、siRNA、shRNA、microRNA或 修饰的核酸。9. 如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述蛋白是肽、修饰的肽、蛋白或修饰的蛋 白。10. -种复合物，其特征在于，包括含有如权利要求1所述的胍基取代的芳香化合物修 饰的高分子材料和核酸或蛋白，由所述高分子材料携带所述核酸或蛋白。
【专利摘要】本发明提供一种如式(1)所示的胍基取代的芳香化合物修饰的高分子材料，其包括阳离子高分子骨架和胍基取代的芳香化合物功能基团，所述胍基取代的芳香化合物功能基团共价连接在阳离子高分子骨架的表面。本发明还提供所述高分子材料的制备方法及其作为核酸和蛋白分子输送载体的应用。本发明的合成方法成本低廉，合成方法简单。所合成的高分子材料细胞毒性小，是一种应用前景良好的高分子材料。
【IPC分类】C12N5/09, C12N15/87, C08G83/00
【公开号】CN105418939
【申请号】CN201510933767
【发明人】程义云, 常虹, 吕佳, 刘红梅
【申请人】华东师范大学
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2015年12月15日