酵母或其他真 菌）、植物细胞(例如烟草或西红柿植物细胞）、动物细胞(例如人细胞、猴细胞、仓鼠细胞、大 鼠细胞、小鼠细胞或昆虫细胞）或杂交瘤。宿主细胞的例子包括猴肾细胞的C0S-7系（ATCC CRL 1651)(见Gluzman et al.，1981，061123:175)儿细胞，(：127细胞，3了3细胞以了〇：〇(^ 163)、中华仓鼠卵巢(CH0)细胞或它们的衍生物，例如Veggie CH0和生长于无血清培养基中 的相关细胞系（见Rasmussen等，1998，Cytotechnology 28:31)，或DHFR缺陷的CH0株系DX-Bl 1 (见Urlaub等，1980，Proc · Natl · Acad · Sci · USA 77:4216-20)，Hela细胞，BHK(ATCC CRL 10)细胞系，源于非洲绿猴肾细胞系CV1(ATCC CCL 70)的CV1/EBNA细胞系（见McMahan等， 1991，EMB0 J.10:2821)，人胚胎肾细胞例如293、293 EBNA或MSR 293,人表皮A431细胞，人 C〇1〇205细胞，其它经转化的灵长类细胞系，正常二倍体细胞，源于原生组织的体外培养物 的细胞株系，原生外植体，HL-60，U937，HaK或Jurkat细胞。典型地，宿主细胞是可被编码多 肽的核酸转化或转染的培养的细胞，其然后可表达于宿主细胞中。短语"重组宿主"可用于 指已经被待表达的核酸转化或转染的宿主细胞。宿主细胞还可以是下述细胞，其包含核酸 但是并不以想要的水平表达该核酸，除非向宿主细胞中引入了调控序列使得其与核酸可操 作地连接。应当理解，术语宿主细胞不仅指特定的受试者细胞，其还指此类细胞的后代或潜 在后代。因为由于例如突变或环境影响，在以后的传代中可能发生某些修饰，故而此类后代 可能事实上不与亲本细胞相同，但仍包括在本文使用的术语的范围内。
[0072] 抗原结合蛋白质
[0073] 在一个方面，本发明提供了结合肌肉生长抑制素(例如人肌肉生长抑制素）的抗原 结合蛋白质(例如抗体、抗体片段、抗体衍生物、抗体突变蛋白质和抗体变体）。
[0074] 根据本发明的抗原结合蛋白质包括抑制肌肉生长抑制素生物活性的抗原结合蛋 白质。此类生物活性的例子包括肌肉生长抑制素与肌肉生长抑制素受体的结合以及与表达 此类肌肉生长抑制素受体的细胞的结合。其它生物活性包括肌肉生长抑制素体内介导的那 些，例如对骨骼肌生长的负调控。
[0075] 不同的抗原结合蛋白质可结合肌肉生长抑制素的不同结构域或表位或者通过不 同的作用机制发挥作用。粒子包括但不限于干扰肌肉生长抑制素或肌肉生长抑制素受体的 能力的抗原结合蛋白质或其亚单位。抗原结合蛋白质无须完全抑制肌肉生长抑制素诱导的 活性来在本发明中应用；而也可考虑降低肌肉生长抑制素的特定活性的抗原结合蛋白质 (本文关于结合肌肉生长抑制素的抗原结合蛋白质在治疗特定疾病中的特定作用机制仅用 于阐述，本文给出的方法并非限定性的）。
[0076] 本发明范围的抗肌肉生长抑制素抗体的其它衍生物包括抗肌肉生长抑制素抗体 与其它蛋白质或多肽的共价或聚集缀合物或其片段，例如通过表达包含融合至抗肌肉生长 抑制素抗体多肽的N-末端或C-末端的异源多肽的重组融合蛋白质来获得。例如，缀合肽可 以是异源信号(或前导序列）多肽，例如酵母因子前导序列，或肽例如表位标签。含有抗原 结合蛋白质的融合蛋白质可包括添加来协助对抗原结合蛋白质的纯化或鉴定的蛋白质（例 如标签蛋白质，例如多聚His)。抗原结合蛋白质还可连接至Hopp等，Bio/Technology 6 : 1204,1988和美国专利5,011，912所述的FLAG?肽。FLAG?肽是高度抗原性的，并且 提供被特异性单克隆抗体(mAb)可逆结合的表位，使得能够进行快速检验并且容易对表达 的重组蛋白质进行纯化。可用于制备其中FLAG?肽融合至给定多肽的融合蛋白质的试 剂是可商业获得的（3丨811^-41(11'；[(311，31:丄011丨8]\0)。
[0077] 含有一种或多种抗原结合蛋白质的寡聚物可用作为肌肉生长抑制素拮抗剂。寡聚 物可以是共价连接或非共价连接的二聚体、三聚体或更高聚的寡聚物。考虑使用包含两种 或多种抗原结合蛋白质的寡聚物，一个例子是同源二聚体。其它寡聚物包括异源二聚体、同 源三聚体、异源三聚体、同源四聚体、异源四聚体等等。
[0078] -种实施方式涉及包含经由融合至抗原结合蛋白质的肽基元之间的共价或非共 价相互作用相连的多个抗原结合蛋白质的寡聚物。此类肽可以是肽接头（间隔序列)或具有 促进寡聚化的性质的肽。亮氨酸拉链和源于抗体的某些多肽属于能促进与之连结的抗原结 合蛋白质的寡聚化的肽，如下文更详细描述的。
[0079] 在一些特别地实施方式中，寡聚物包含两个或四个抗原结合蛋白质。寡聚物的抗 原结合蛋白质可以是任何形式的，例如上文所述的任何形式，例如变体或片段。优选地，寡 聚物包含具有肌肉生长抑制素结合活性的抗原结合蛋白质。
[0080] 在一种实施方式中，使用源于免疫球蛋白质的多肽来制备寡聚物。已经描述了对 包含融合至源于抗体的多肽的多种部分(包括Fc结构域）的某些异源多肽的融合蛋白质的 制备，例如，由Ashkenazi等，1991，PNAS USA 88:10535、Byrn等，1990，Nature 344:677和 Hollenbaugh等，1992〃Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins"，in Current Protocols in Immunology，Suppl .4,10.19.1-10.19.11 页描述。
[0081 ]本发明的一种实施方式涉及包含两个融合蛋白质的二聚体，所述融合蛋白质是通 过将抗肌肉生长抑制素抗体的肌肉生长抑制素结合片段融合至抗体的Fc区制造的。可通过 下述方式来制造二聚体:例如将编码融合蛋白质的基因融合子插入合适的表达载体，在经 重组表达载体转化的宿主细胞中表达基因，以及允许表达的融合蛋白质装配得很像抗体分 子，由此在Fc基元之间形成链间二硫键，以产生二聚体。
[0082] 术语"Fc多肽"在本文中使用时包括源于抗体的Fc区的多肽的天然和突变蛋白质 形式。此类多肽的含有促进二聚化的铰链区的截短形式也包括在内。包含Fc基元的融合蛋 白质（和由其形成的寡聚体)提供了易于通过在蛋白质A或蛋白质G柱上进行亲和色谱来纯 化的优点。
[0083] PCT申请W0 93/10151(其通过引用并入本文）中描述的一种合适的Fc多肽是单练 多肽，其从N-末端铰链区延伸至人IgGl抗体的Fc区域的天然C-末端。另一有用的Fc多肽是 美国专利5，457，035和Baum等，1994，ΕΜΒ0 J. 13:3992-4001中描述的Fc突变蛋白质。该突变 蛋白质的氨基酸序列除了第19位氨基酸从Leu变为Ala、第20位氨基酸从Leu变为Glu以及第 22位氨基酸从Gly变成Ala之外与W093/10151中呈现的天然Fc序列相同。突变蛋白质显示出 针对Fc受体的降低的亲和性。
[0084] 在其它一些实施方式中，抗肌肉生长抑制素抗体的重链和/或轻链的可变部分可 取代抗体重链和/或轻链的可变部分。
[0085] 或者，寡聚物是包含多个抗原结合蛋白质、有或没有肽接头（间隔肽）的融合蛋白 质。其中合适的肽接头是美国专利4，751，180和4，935，233描述的那些。
[0086] 用于制备寡聚抗原结合蛋白质的另一方面涉及亮氨酸拉链的使用。亮氨酸拉链结 构域是促进其中发现有它们的蛋白质的寡聚化的肽。亮氨酸拉链最初被鉴定于若干DNA结 合蛋白质中（Landschulz等，1988，Science 240:1759)，此后还被发现于多种不同的蛋白质 中。已知的亮氨酸拉链包括天然存在的肽及其二聚化或三聚化的衍生物。适用于生产可溶 寡聚蛋白质的亮氨酸拉链结构域的例子被描述于PCT申请W0 94/10308中，源于肺表面活性 蛋白质D(SPD)的亮氨酸拉链被描述于Hoppe et al.，1994，FEBS Letters 344:191中，上述 文献通过引用引用并入本文。允许融合至其的异源蛋白质稳定三聚化的经修饰的亮氨酸拉 链的用途被描述于Fanslow等，1994，Semin. Immunol .6:267-78中。在一种方法中，包含融合 至亮氨酸拉链肽的抗肌肉生长抑制素抗体片段或衍生物的重组融合蛋白质被表达于合适 的宿主细胞中，从培养物上清液中回收形成的可溶寡聚抗肌肉生长抑制素抗体片段或衍生 物。
[0087] 在一个方面，本发明提供了干扰肌肉生长抑制素与肌肉生长抑制素受体的结合的 抗原结合蛋白质或其亚单位。例如，抗原结合蛋白质可阻碍肌肉生长抑制素与ALK4的相互 作用，但还可以共结合与ActRIIB复合的肌肉生长抑制素和/或与AcRIIA复合的肌肉生长抑 制素。此类抗原结合蛋白质可针对肌肉生长抑制素或其片段、变体或衍生物来制造，并在传 统检验中针对干扰肌肉生长抑制素受体(或表达此类受体的细胞)的能力对其加以筛选。合 适的检验的例子是测试抗原结合蛋白质的抑制肌肉生长抑制素与表达肌肉生长抑制素受 体的细胞结合的能力的测试、或测试抗原结合蛋白质的降低此类受体和肌肉生长抑制素相 互作用导致的生物或细胞应答的能力的测试（即基于细胞的检验、体外结合检验，例如本文 在实施例中描述的那些）。测试抗原结合蛋白质的额外检验包括对抗原结合蛋白质与肌肉 生长抑制素多肽的结合和已知的抗原结合蛋白质与肌肉生长抑制素多肽的结合进行定性 或定量比较，其若干例子公开于本文中。
[0088] 在又一方面，本发明提供了展示出物种选择性的抗原结合蛋白质。在一种实施方 式中，抗原结合蛋白质结合一种或多种哺乳动物肌肉生长抑制素，例如结合人肌肉生长抑 制素、和小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、猫、兔、狗、山羊、绵羊、牛、马、骆驼和非人灵长类肌肉 生长抑制素中的一种或多种。在又一实施方式中，抗原结合蛋白质结合一种或多种灵长类 肌肉生长抑制素，例如结合人肌肉生长抑制素、和猕猴、狨猴、恒河猴、絹毛猴和黑猩猩肌肉 生长抑制素中的一种或多种。在又一实施方式中，抗原结合蛋白质特异性结合人、猕猴、狨 猴、恒河猴、絹毛猴或黑猩猩肌肉生长抑制素。在又一实施方式中，抗原结合蛋白质不结合 小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、猫、兔、狗、山羊、绵羊、牛、马、骆驼和非人灵长类肌肉生长抑 制素中的一种或多种。在又一实施方式中，抗原结合蛋白质不结合新世界猴(New World monkey)物种例如绒猴。
[0089] 在又一实施方式中，抗原结合蛋白质不显示出对除了肌肉生长抑制素之外的任何 天然存在的蛋白质的特异性结合。在又一实施方式中，抗原结合蛋白质不显示出对除了哺 乳动物肌肉生长抑制素之外的任何天然存在的蛋白质的特异性结合。在又一实施方式中， 抗原结合蛋白质不显示出对除了灵长类肌肉生长抑制素之外的任何天然存在的蛋白质的 特异性结合。在又一实施方式中，抗原结合蛋白质不显示出对除了人肌肉生长抑制素之外 的任何天然存在的蛋白质的特异性结合。在又一实施方式中，抗原结合蛋白质特异性结合 来自至少一种非人灵长类(例如猕猴)的肌肉生长抑制素和人肌肉生长抑制素。在又一实施 方式中，抗原结合蛋白质以相似的结合亲和性特异性结合非人灵长类、猕猴和人肌肉生长 抑制素。在又一实施方式中，抗原结合蛋白质阻碍非人灵长类、猕猴和人肌肉生长抑制素的 活性。在又一实施方式中，在本文所述的检验中，抗原结合蛋白质针对非人灵长类、猕猴和 人肌肉生长抑制素具有相似的IC 5Q或EC50。
[0090] 可以使用本领域公知的方法，以及按照本说明书的教导，来测定抗原结合蛋白质 对肌肉生长抑制素的选择性。例如，可以使用Western印迹杂交、FACS、ELISA、RIA或通过允 许测定结合常数的任何合适的方法，例如Biacore? (其利用表面等离子共振）或 KinexA? (动力学排斥检验（kinetic exclusion assay)，见例如Ohmura 等，， Anal · Chem · 73:3392-3399，2001)来测定选择性。
[0091] 在又一方面，本发明提供了具有下述特征中一种或多种的结合肌肉生长抑制素的 抗原结合蛋白质（例如抗肌肉生长抑制素抗体）：既结合人肌肉生长抑制素又结合非人灵长 类肌肉生长抑制素，抑制肌肉生长抑制素与肌肉生长抑制素受体的结合，抑制肌肉生长抑 制素与ALK4的结合，与肌肉生长抑制素/ActRIIB共结合，与肌肉生长抑制素/ActRIIA共结 合，抑制肌肉生长抑制素负调控肌肉质量的能力。
[0092] 本发明的抗原结合蛋白质的抗原结合片段可通过传统技术来生产。此类片段的例 子包括但不限于Fab和F(ab'）2片段。通过遗传工程技术产生的抗体片段和衍生物也包括在 内。
[0093] 另外的实施方式包括嵌合抗体，例如非人(例如鼠）单克隆抗体的人化版本。此类 人化抗体可通过已知技术来制备，并且当抗体施用给人时提供降低的免疫原性的优点。在 一种实施方式中，人化单克隆抗体包含鼠抗体的可变区（或者其抗原结合位点的全部或部 分)和来自人抗体的恒定结构域。或者，人化抗体片段可包含鼠单克隆抗体的抗原结合位点 和源于人抗体的可变结构域片段(缺少抗原结合位点）。用于产生嵌合及经进一步工程化的 单克隆抗体的流程包括Riechmann 等，·，1988, Nature 332:323, Liu 等，，1987， Proc.Nat.Acad·Sci.USA 84:3439，Larrick等，·，1989，Bio/Technology 7:934和Winter 等，.，1993，TIPS14:139中描述的那些。在一种实施方式中，嵌合抗体是⑶R移植的抗体。用 于人化抗体的技术被讨论于例如美国专利申请No. 10/194,975(2003年2月27日公开）、美国 专利No·s 5,869,619、5,225,539、5,821，337、5,859,205、Padlan等，，1995，FASEBJ·9: 133-39和Tamura等，，2000，J · Immunol · 164:1432-41 中。
[0094]已经开发了用于在非人动物中产生人或部分人抗体的流程。例如，已制备了其中 一种或多种内源免疫球蛋白基因已被多种手段失活的小鼠。人免疫球蛋白基因已被引入小 鼠以代替失活的小鼠基因。动物中产生的抗体掺入了引入动物的人遗传材料编码的人免疫 球蛋白多肽链。在一种实施方式中，用肌肉生长抑制素多肽对非人动物例如转基因小鼠进 行免疫，使得在动物中产生针对肌肉生长抑制素多肽的抗体。合适的免疫原的一个例子是 可溶的人肌肉生长抑制素，例如包含肌肉生长抑制素的蛋白质切割位点的多肽，或其它免 疫原性片段肌肉生长抑制素。合适的免疫原的另一例子是表达高水平肌肉生长抑制素的细 胞或来自其的细胞膜制备物。
[0095] 用于生产和使用用于产生人或部分人抗体的转基因动物的技术的例子被描述于 美国专利5,814,318、5,569,825和5,545,806,03￥丨8等，，2003，卩仰(111(^丨〇11(^111111^11 antibodies from transgenic mice，于Lo，ed·Antibody Engineering:Methods and Protoco 1 s中，Humana Press，NJ:191-200，Ke11ermann等，，2002，Curr Opin Biotechnol · 13:593-97，Russel等，，2000，Infect Tmmun ·68:1820-26，Gallo等，，2000，Eur J Immun.30:534-40，Davis等，，1999，Cancer Metastasis Rev.l8:421_25，Green，1999，J Immunol Methods .231:11-23,Jakobovits,1998,Adv Drug Deliv Rev 31:33-42,Green 等，，1998，J Exp Med.l88:483_95，Jakobovits A，1998，Exp.0pin.Invest.Drugs.7:607-14，Tsuda等，，1997，Genomics 42:413-21，Mendez 等，，1997, Nat Genet.l5:146-56， Jakobovits，1994，Curr Biol·4:761-63，Arbones等，，1994，Immunity·1:247-60，Green 等，，1994，Nat Genet · 7:13-21，Jakobovits等，，1993，Nature 362: 255-58，Jakobovits 等，，1993，Proc Natl Acad Sci U S A.90: 2551-55，Chen，J.等，，1993，lnt Immunol 5: 647_656，Choi等，，1993，Nature Genetics 4:117_23，Fishwild等，，1996，Nat Biotechnol 14:845-51，Harding et al.,1995，Ann NY Acad Sci,Lonberg等，，1994，Nature 368:856-59，Lonberg，1994，Transgenic Approaches to Human Monoclonal Antibodies，于 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101 中，Lonberg等，，1995，lnt Rev Immunol 13:65_93，Neuberger，1996，Nat Biotechnol 14:826，Taylor等，，1992，Nucleic Acids Research 20 :6287-95，Taylor等，，1994，lnt Immunol 6: 579-91，Tomizuka等，， 1997,Nat Gen 16:133-43,Tomizuka et al.,2000,Proc Natl Acad Sci U S A.97:722-27，Tuaillon et al.，1993，Proc Natl Acad Sci U S Α·90:3720_24和Tuaillon et al·, 1994J Immunol 152:2912-20中。这些和其它例子也被讨论于2007年5月3日公开的美国专 利申请公开文本2007-0098715中。
[0096] 在又一方面，本发明提供了结合肌肉生长抑制素的单克隆抗体。可使用本领域已 知的任何技术来生产单克隆抗体，例如通过在完成免疫程序之后永生化收获自转基因动物 的脾细胞。可使用本领域已知的任何技术来永生化脾细胞，例如通过将它们与骨髓瘤细胞 融合以产生杂交瘤。用于产生杂交瘤的融合流程的骨髓瘤细胞优选不产生抗体、具有高融 合效率，使得它们不能在仅支持想要的融合细胞(杂交瘤)生长的某些选择性培养基上生长 的酶缺陷。用于小鼠融合的合适的细胞系的粒子包括Sp-20、P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、 NSl/l.Ag 41、Sp210-Agl4、F0、NS0/U、MPC-ll、MPCll-X45-GTG 1.7和S194/5XX0Bul;用于大 鼠融合的细胞系的例子包括R210.RCY3、Y3-Ag 1.2.3、11?983?和48210。可用于细胞融合的 其它细胞系是 U-266、GM1500-GRG2、LICR-L0N-HMy2 和 UC729-6。
[0097] 在一种实施方式中，通过下述方式产生杂交瘤细胞系：用肌肉生长抑制素免疫原 免疫动物(例如具有人免疫球蛋白序列的转基因动物）、从经免疫的动物收获脾细胞、将收 获的脾细胞融合至骨髓瘤细胞系由此产生杂交瘤;从杂交瘤细胞建立杂交瘤细胞系以及鉴 定产生结合肌肉生长抑制素多肽的抗体的杂交瘤细胞系。此类杂交瘤细胞系和通过它们产 生的抗肌肉生长抑制素单克隆抗体是本发明所包括的。
[0098] 可以使用本领域已知的任何技术来纯化通过杂交瘤细胞系分泌的单克隆抗体。可 进一步筛选