;其余部分为 VQR蛋白序列，改造位点计数从VQR蛋白编码序列开始。
[0051] 表1各片段的扩增引物
[0052]
[0053] 实施例2、GL1-1基因 sgRNA的设计及重组质粒构建
[0054] 选择化 1-1 基因序列"5 ' -ATCGCCCTCTACCTCTGCAGGA"为祀序列/'GGA"为PAM序列， 下划线为PstI酶切识别位点。合成正负两条寡核巧酸链，如表2所示。100μΜ的g++与g-引物 (即，表2中的寡核巧酸引物（5'-3'））各20化混合，100°C放置5分钟后置于室溫，逐渐冷却， 变性退火，形成带有粘性末端的片段(即，g++/g-引物退火产物）。
[005引将SK-gRNA进行Aarl酶切(酶及体系所用试剂均购自化rment公司），形成带有粘性 末端的载体，酶切反应体系如下：
[0056]
[0057] 备注说明：SK-gRNA可来自申请号201510485573.2。
[005引 37°C酶切3小时，用Biomed胶回收试剂盒(Biomed，DR0103)按产品说明书进行纯 化;得线性载体SK-gRNA/Aarl。
[0059] 将载体和片段进行T4酶(购自肥B公司)连接，反应如下：
[0060]
[0061] 室溫反应1小时。连接产物扣L转化大肠杆菌感受态细胞DH5a得到连接质粒SK- 排NAGli-1。用引物T7:5 ' -TAATACGACTCACTATAGG-3 '，测序确定克隆构建正确。即，含有VQR及 祀位点相关序列。
[0062] 将测序正确的SK-gRNAGLi-i质粒用时η巧日Bgin双酶切，用Biomed胶回收试剂盒 (Biomed，DR0103)按产品说明书进行纯化，得线性片段。将此线性片段连入PC1300-VQR双元 载体（即，实施例1所得的重组质粒PC1300-VQR)的BamH巧日ΚρηΙ识别位点间，得到最终敲除 水稻双元表达载体目(：1300-VQR-gRNA*^LH。
[0063] KpnI、BglII、BamHI及体系内其他试剂均购自TAKARA公司，双酶切体系如下：
[0064]
[0065] 37°C酶切3小时，用Biomed胶回收试剂盒(Biomed,DR0103)按产品说明书进行纯 化;得线性片段曲臟*=^-1/邱111+8肖1 II。
[0066]
[0067] 37°C酶切3小时，用Biomed胶回收试剂盒(Biomed，DR0103)按产品说明书进行纯 化;得线性载体 pCl 300-VQR/KpnI+BamHI。
[006引连接反应如下：
[0069]
[0070] 室溫反应1小时。取连接产物化L用于转化大肠杆菌感受态细胞DH5,得到连接质 粒。用引物PC1300-F: 5 ' -ACACTTTATGCTTCCGGCTC-3 '，测序确定克隆构建正确。当测序结果 与设计序列(包含祀位点序列）比对相符合时，判定构建正确;反之，则为构建不正确。
[00川表2化1-1的祀位点、寡核巧酸、引物
[0072]
[0073] 实施例3、转基因植株的获得
[0074] 将上述最终敲除水稻双元表达载体9(：1300-￥91?-邑1?酷*=^-1通过电击的方法转入农 杆菌(Agrobacterium)株系EHA105中，利用农杆菌介导法将此双元表达载体转入水稻日本 晴的成熟胚愈伤组织。转化的具体方法是将日本晴种子的成熟胚灭菌后切出，接种到诱导 愈伤组织的培养基中。培养1周后，挑选生长旺盛，颜色浅黄，比较松散的胚性愈伤组织，用 作转化的受体。用含有9(：1300-￥91?-邑1?酷*=^-1质粒的6齡105菌株侵染水稻愈伤组织，在黑暗 处25°C培养3天后，在含有50mg/L潮霉素的选择培养基上筛选抗性愈伤组织和转基因植株。 挑选在潮霉素选择培养基上正常生长的转基因植株，进行鉴定。
[0075] 实施例4、转基因植株的鉴定
[0076] 1.酶切鉴定
[OOW]利用分子生物学手段鉴定目的基因突变情况。CTAB法单株提取野生型对照及实施 例3所得的转基因植物基因组DNA，使用表2所述引物及K0D FX DNA聚合酶(购自东洋纺生物 科技有限公司)PCR扩增目的条带，反应条件如下：
[007 引
[0079]
[0080] 反应程序:94°C，变性2分钟;然后98°C变性10秒，58°C退火30秒，68°C延伸40秒，扩 增34个循环;最后在68°C下延伸5分钟。
[0081 ] 得到的PCR产物，约602bp，使用Pstl(购自肥B公司）进行酶切检测，体系如下：
[0082]
[0083] 37°C酶切3小时，2%的琼脂糖凝胶电泳（145V)25min，结果如图2所示，被完全降解 为35869和24469两个较小条带的样品为野生型和敲除阴性(如巧*和1~5,7~9，11~14，16， 18~20);完全未被降解的样品为敲除纯合体(结果图中无明显敲除纯合体，敲除纯合体理 论上应与最后一个泳道带型一致）；含有两种带型的样品为敲除杂合体(如6、10、15、17)。 [0084] 2.测序
[008引将上述PCR产物送测序公司（杭州擎科梓熙生物技术有限公司），W表2中F为引物 测序。所得结果与野生型序列进行比对。测序结果为双峰的，用简并密码子策略分析 化ttp://dsdecode. scgene. com/进行峰图分析），可直接获得杂合突变信息。结果如图3所 示，均有不同程度的敲除纯合体、杂合体检出。
[0086] 3.表型鉴定
[0087] 如图4所示，将清水滴至叶片表面，若水能维持水滴性状，可说明水稻叶面具有蜡 质合成，即为野生型。反之(即不能维持水滴状），则说明蜡质基因被破坏，为敲除阳性植株。 [008引结论；
[0089]原始的Cas9基因所表达的化s9蛋白只能在PAM区为5'-NGG-3'的情况下实现基因 组编辑功能。而相比于原始的化s9蛋白，VQR(变体化s9蛋白）能够在PAM区为5'-NGA-3'的情 况下实现基因组编辑功能，而普通Cas9蛋白则无法在该情况下实现编辑。备注说明：N代表 为A，T，C，G任意一种核巧酸，本案例中（图3)，N则为G。
[0090] 实施例5、将实施例2~4中的基因化1-1改成NAL1 (包含上标中所含有的化1-1，均 0?^ΝΑ11) ,)lt"5'-ATCGCCCTCTACCT CTGCAG G A " 改为"5 > - GCTATTGAGCGGACACTGCAGA" /屯GA"改为"AGA";所使用的体系、方法均不变，使用到的寡核巧 酸引物g++/g-改为 "g++: GGCAGCTATTGAGCGGACACTGC; g-: AAACGCAGTGTCCGCTCAATAGC' ；引 物 F/R 改为 "F: TCATATTAATGCCGGATTGC; R: CAAGTTCCAGACGGTCGA 护。
[0091] 其结果如下:CTAB法单株提取野生型对照及所得的转基因植物基因组DNA，使用上 述引物及K0D FX DNA聚合酶(购自东洋纺生物科技有限公司）PCR扩增目的条带，反应条件 如下：
[0092]
[0093] 反应程序:94°C，变性2分钟;然后98°C变性10秒，58°C退火30秒，68°C延伸40秒，扩 增34个循环;最后在68°C下延伸5分钟。
[0094] 得PCR产物，约663bp，W上述F为引物测序。所得结果与野生型序列进行比对。测序 结果为双峰的，用简并密码子策略分析化ttp: //dsdecode. scgene. com/进行峰图分析），可 直接获得杂合突变信息。结果如图5所示，均有不同程度的敲除纯合体、杂合体检出。
[0095] 最后，还需要注意的是，W上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发 明不限于W上实施例，还可W有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容 直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【主权项】
1. 植物Cas9变体蛋白VQR，其特征是:该蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID N〇:2所示。2. 植物Cas9变体蛋白VQR，其特征是:所述蛋白质还包括在SEQ ID NO:2所示的氨基酸 序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个氨基酸生成的衍生物。3. 植物Cas9变体基因 VQR，其特征是:该基因编码植物Cas9变体蛋白VQR，所述基因的核 苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。4. 植物Cas9变体基因 VQR，其特征是:所述基因还包括在SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序 列中添加、取代、插入和缺失一个或多个核苷酸生成的突变体、等位基因和衍生物。5. 重组表达载体，其特征是:包含权利要求3或4所述的基因。6. 如权利要求1或2所述的植物Cas9变体蛋白VQR的用途，其特征是:能够在PAM区为5 ' -NGA-3'的情况下实现基因组编辑功能。
【专利摘要】本发明公开了一种植物Cas9变体蛋白VQR，该蛋白质的氨基酸序列如SEQ？ID？No：2所示。本发明还同时公开了植物Cas9变体基因VQR，该基因编码植物Cas9变体蛋白VQR，所述基因的核苷酸序列如SEQ？ID？NO：1所示。本发明还同时公开了包含上述基因的重组表达载体。本发明的植物Cas9变体蛋白VQR的用途是：能够在PAM区为5’-NGA-3’的情况下实现基因组编辑功能。
【IPC分类】C12N15/55, C12N15/10, C12N9/22, C12N15/63
【公开号】CN105543195
【申请号】CN201610113183
【发明人】王克剑, 胡熙璕, 王春, 付亚萍, 刘庆, 焦晓真
【申请人】中国水稻研究所
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年3月1日